2.7.8. Количественное определение вакцины столбняка (адсорбированной)

Количественное определение вакцины столбняка (адсорбированной) производят путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты морских свинок или мышей от эффектов паралитической дозы вводимого подкожно токсина столбняка, с дозой препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующейся для получения такой же защиты. В странах, где метод паралича не является обязательным, может использоваться метод LD50. В этом случае количества животных и методики идентичны описываемым для метода паралича, но за конечную точку принимают вместо паралича гибель животных.

За Международную Единицу принимают активность в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из столбнячного анатоксина, адсорбированного на гидроксиде алюминия. Эквивалентность Международного

Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

В нижеописанном методе количественного определения используется модель параллельных линий с использованием трех разведений испытуемого и стандартного препаратов. Если аналитик обладает достаточно большим опытом работы с применением этого метода для данной вакцины, разрешается использовать упрощенную модель, включающую одно разведение для испытуемого и стандартного препаратов. Такая модель позволяет определять, обладает ли вакцина активностью, существенно превышающей необходимый минимум, но не дает информации о линейности и параллельности и кривой зависимости отклика от дозы. Упрощенная модель приводит к существенному уменьшению требуемого количества экспериментальных животных; она должна приниматься во внимание каждым аналитиком в соответствии с положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.

ИСПЫТАНИЕ НА МОРСКИХ СВИНКАХ

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых морских свинок из одной партии с массой тела от 250 до 350 г. Морских свинок делят не менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по пять морских свинок в качестве невакцинированного контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного токсина. Препарат токсина столбняка должен содержать не менее пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы в миллилитре. Если было показано, что препарат токсина обладает стабильностью, проверка его паралитической дозы перед каждым определением не является обязательной.

Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы в миллилитре. При необходимости порции раствора провокационного токсина разбавляют тем же растворителем в соотношениях 1:16, 1:50 и 1:160.

Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе 1,0 мл защищают около 50% животных от паралитических эффектов, вызываемых подкожным введением количества токсина столбняка, предписанного для этого испытания. Каждое разведение назначают одной из групп морских свинок, каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней каждому животному вводят подкожно по 1,0 мл раствора провокационного токсина (содержащего пятидесятикратную 50%-ную паралитическую дозу).

Определение активности провокационного токсина. При необходимости, раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения назначают по одному каждой из 4 групп по 5 морских свинок и вводят подкожно по 1,0 мл каждого разведения каждой из морских свинок группы, которой это разведение было назначено.

Получение и интерпретация результатов. Состояние морских свинок оценивают дважды в день. Животных с определенными признаками столбнячного паралича изымают и гуманным образом умерщвляют. Через 5 дней после инъекции провокационного токсина подсчитывают число непарализованных морских свинок. Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции непарализованных животных в каждой из групп вакцинированных морских свинок.

Требования к достоверности определения. Результаты испытания являются достоверными, если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,

- в случае проведения соответствующего испытания, количество парализованных животных в 4 группах по 5 морских свинок, которым был введен раствор провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокация составляла около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы,

• границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50 до 200% от оцененного значения активности,

• при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.

ИСПЫТАНИЕ НА МЫШАХ

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей из одной партии с массой тела от 14 до 20 г. Мышей делят не менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по шесть мышей в качестве невакцинированного контроля. Используют мышей одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного токсина. Препарат токсина столбняка должен содержать не менее стократной 50%-ной паралитической дозы в миллилитре. Если было показано, что препарат токсина обладает стабильностью, проверка его паралитической дозы перед каждым определением не является обязательной.

Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы в 0,5 мл. При необходимости порции раствора провокационного токсина разбавляют тем же растворителем в соотношениях 1:16, 1:50 и 1:160.

Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в котором промежуточные разведения при подкожном введении мыши в дозе 0,5 мл защищают около 50% животных от паралитических эффектов, вызываемых подкожным введением количества токсина столбняка, предписанного для этого испытания. Каждое разведение назначают одной из групп мышей, каждой из которых вводят подкожно по 0,5 мл этого разведения. Через 28 дней каждому животному вводят подкожно по 0,5 мл раствора провокационного токсина (содержащего пятидесятикратную 50%-ную паралитическую дозу).

Определение активности провокационного токсина. При необходимости раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения назначают по одному каждой из 4 групп по 6 мышей и вводят подкожно по 0,5 мл каждого разведения каждой из мышей группы, которой это разведение было назначено.

Получение и интерпретация результатов. Состояние мышей оценивают дважды в день. Животных с определенными признаками столбнячного паралича изымают и гуманным образом умерщвляют. Через 4 дня после инъекции провокационного токсина подсчитывают число непарализованных мышей. Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции непарализованных животных в каждой из шести групп вакцинированных мышей.

Требования к достоверности определения. Результаты испытания являются достоверными, если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными мышам,

- в случае проведения соответствующего испытания, количество парализованных животных в 4 группах по 6 мышей, которым был введен раствор провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокация составляла около пятидесятикратной 50%-ной паралитической дозы,

• границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50 до 200% от оцененного значения активности,

• при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.