2.2.54. Изоэлектрическое фокусирование

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ, IEF) - это вариант электрофореза, в котором разделение белков происходит в соответствии с их изоэлектрическими точками. Разделение проводится на пластине из полиакриламида или агарозного геля, содержащего смесь амфотерных электролитов (амфолитов). При действии электрического поля амфолиты мигрируют в геле, создавая градиент рН. В некоторых случаях используют гели, имеющие фиксированный градиент рН, полученные путём включения слабых кислот или оснований в определённые места геля во время его приготовления. Когда нанесённые белки достигают фракции геля, которая имеет такое же значение рН, что и их изоэлектрическая точка (pI), заряд данных белков нейтрализуется и миграция прекращается. Градиенты могут быть созданы в различных диапазонах рН в зависимости от выбранной смеси амфолитов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

В изоэлектрической точке молекула белка незаряжена и не может передвигаться в матрице геля под действием электрического поля. Её перемещение, однако, может происходить в результате диффузии. Градиент рН вынуждает белок оставаться в изоэлектрическом состоянии, концентрируя данное вещество. Такое концентрирование называется «фокусирование». Увеличение приложенного напряжения или уменьшение количества нанесённого вещества улучшает разделение полос. Величина приложенного напряжения ограничена выделяющейся теплотой, которая должна быть рассеяна. Использование тонких слоёв геля, а также пластин с эффективным охлаждением, контролируемых термостатирующим устройством, предотвращает возгорание геля и в тоже время обеспечивает точное фокусирование. Разделение оценивают по минимальной разности pI (Dpi), которая необходима для разделения двух соседних полос:

D(dpH : dx)

E(-d/m : dpH)

Dpi = 3 •

где:

D - коэффициент диффузии белка,

dpH

градиент рН,

dx

E - напряжённость электрического поля, в вольтах на сантиметр, dm

изменение подвижности вещества при изменение рН в диапазоне рН

dpH

близком к pI.

dm

Поскольку D и для определённого белка не могут быть изменены, улучшить

dpH

разделение можно при использовании более узкого диапазона рН либо при увеличении напряжённости электрического поля.

Разрешение между полосами белков в случае использования ИЭФ-геля, содержащего ведущие амфолиты, достаточно хорошее. Улучшить разрешение можно при использовании фиксированных градиентов рН, для создания которых применяются буферные вещества, аналогичные ведущим электролитам, сополимеризованные с матрицей геля. При использовании геля, содержащего ведущие электролиты, могут быть разделены белки, значения pI которых отличаются на 0,02 единицы pH, в то время как фиксированные градиенты рН позволяют разделить белки, изоэлектрические точки которых различаются приблизительно на 0,001 pH.

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

Следует уделять особое внимание характеристикам и/или подготовке образца. Наличие солей в образце может вызвать ряд проблем, поэтому лучше

всего при приготовлении образца использовать деионизированную воду или 2%-ный раствор амфолитов, используя при необходимости диализ или гель-фильтрацию.

Время, необходимое для завершения фокусирования в тонком слое полиакриламидных гелей, определяют путём нанесения окрашенного белка (например, гемоглобина) в различные области поверхности геля и применения электрического поля: стабильное состояние достигается тогда, когда все нанесения дают идентичный образец полос.

В некоторых протоколах о завершении фокусирования судят по времени, прошедшему после нанесения образца.

ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на идентичность, В этом случае исследуемый образец, мигрирующий на геле, сравнивается с подходящим стандартным образцом и ИЭФ-градуировочными белками. ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на предельное содержание. При этом плотность полосы на ИЭФ сравнивается соответственно с полосой на ИЭФ, появляющейся при использовании стандартного образца. Если плотность измеряют с помощью денситометра или аналогичного устройства, позволяющего определить относительную концентрацию белка в полосе. ИЭФ может быть также использовано при испытании на количественное содержание белков.

Прибор. Прибор для ИЭФ состоит из:

• управляемого генератора для создания постоянного потенциала, тока и мощности; используются потенциалы величиной 2500 В, они считаются оптимальными для используемых условий работы; рекомендуется источник тока, имеющий постоянную мощность до 30 Вт;

• жесткая пластиковая ИЭФ камера, в которой находится охлаждаемая пластинка или подходящий материал, служащий основой для нанесения геля;

• пластиковая крышка с платиновыми электродами, которые соединены с гелем с помощью бумажных фитилей подходящей ширины, длины и толщины, пропитанных растворами анодных и катодных электролитов.

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ В ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЯХ:

ПОДРОБНАЯ МЕТОДИКА

Следующая методика представляет собой подробное описание процедуры ИЭФ в пластинах полиакриламидного геля, используемой, если иное не указано в монографии.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЕЙ

Матрица формования. Матрица формования (см. Рисунок 2.2.54.-1) состоит из стеклянной пластинки (A,) на которую для облегчения работы с гелем помещена полиэфирная плёнка (B), одной или нескольких распорных деталей (C), второй стеклянной пластинки (D) и зажимов, скрепляющих всю конструкцию.

7,5%-ный полиакриламидный гель. Растворяют 29,1 г акриламида R и 0,9 г метиленбисакриламида R в 100 мл воды R. К 2,5 объёмам этого раствора прибавляют смесь амфолитов, указанных в частной статье, и разбавляют до 10 мл водой R. Раствор аккуратно перемешивают и дегазируют.

Приготовление формы. Полиэфирную плёнку помещают на нижнюю стеклянную пластинку, вставляют распорную деталь, помещают вторую стеклянную пластинку и скрепляют конструкцию зажимами. Перед использованием раствор помещают на магнитную мешалку и прибавляют к нему 0,25 объёма 100 г/л раствора аммония персульфата R и 0,25 объёма тетраметилэтилендиамина R. Немедленно заполняют раствором пространство между стеклянными пластинками формы.

Методика. Форму разбирают на составные части и, используя полиэфирную плёнку, переносят гель на охлаждённую подложку, увлажнённую несколькими миллилитрами подходящей жидкости, избегая образования воздушных пузырьков. Готовят исследуемый раствор и растворы сравнения как указано в частной статье. Для нанесения образца помещают полоски бумаги размером приблизительно 10 мм х 5 мм на поверхность геля и пропитывают каждую предписанным количеством исследуемого раствора и раствора сравнения. Также наносят предписанное количество раствора белков с известными величинами изоэлектрических точек, служащих в качестве маркеров рН для градуировки геля. В некоторых протоколах вместо использования импрегнированных бумажных полосок используется гель, который имеет желобки, предназначенные для помещения раствора образца. Отрезают 2 полоски бумаги длиной, соответствующей длине геля, и пропитывают их растворами электролитов: кислотой для анода и щелочью для катода. Составы анодного и катодного растворов приводятся в монографиях. Эти бумажные фитильки помещают на каждую сторону геля на расстоянии нескольких миллиметров от его границы. Устанавливают крышку так, чтобы электроды пришли в контакт с полосками бумаги (соответственно анодным и катодным полями). Выполняют изоэлектрическое фокусирование при использовании электрических параметров, описанных в монографии. Когда миграция смеси стандартных белков стабилизируется, электрический ток выключают. С помощью пинцета удаляют полоски, предназначенные для нанесения образца, и 2 электродных фитилька. Погружают гель в фиксирующий раствор для изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле R. Выдерживают при аккуратном встряхивании при комнатной температуре в течение 30 минут. Удаляют раствор высушиванием и добавляют 200 мл обесцвечивающего раствора R. Выдерживают при перемешивании в течение 1 часа. Высушивают гель, добавляют кумасси окрашивающий раствор R. Выдерживают в течение 30 минут. Обесцвечивают гель путём пассивной диффузии обесцвечивающего раствора R до тех пор, пока на чистом фоне не станут хорошо видны полосы. Отмечают положение и интенсивность полос на электрофореграмме, как указано в монографии.

ИЗМЕНЕНИЯ ПОДРОБНОЙ МЕТОДИКИ (ПРЕДМЕТ ВАЛИДАЦИИ)

Там, где делается ссылка на общую методику изоэлектрического фокусирования, изменения в методологии или методике изоэлектрического фокусирования могут быть предметом валидации. Они включают в себя:

• использование имеющихся в продаже гелей заводского производства, а также окрашивающих и обесцвечивающих наборов,

• использование фиксированных градиентов рН,

• использование стержневых гелей,

• использование кассет геля различных размеров, включая ультратонкие (0,2 мм) гели,

• изменения в методике нанесения образца, включающие различные объёмы образца или использование шаблонов или фитильков, изготовленных не из бумаги,

• использование альтернативных условий перемещения, включающих изменения электрического поля в зависимости от размеров геля и оборудования, а также использование фиксированных времен миграции вместо субъективной интерпретации стабильности полосы,

• включение стадии предварительного фокусирования,

• использование автоматизированного оборудования,

• использование гелей агарозы.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ

Если используются альтернативные способы по отношению к подробной методике, они должны быть валидированы. Для валидации разделения могут быть использованы следующие критерии:

- образование устойчивого градиента рН с желаемыми характеристиками, оцениваемого, например, с помощью окрашенных маркеров рН с известными величинами изоэлектрических точек,

• сравнение с электрофореграммами, полученными при использовании химического образца сравнения для исследуемого образца,

• любые другие критерии валидации, указанные в монографии.

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ МЕТОДИКИ

Изменения общей методики, необходимые при анализе некоторых веществ, могут быть подробно описаны в частных статьях. Они включают:

- добавление в гель мочевины (обычно 3 M концентрации достаточно для поддерживания белка в растворённом состоянии, но может быть использована концентрация до 8 M): некоторые белки в изоэлектрической точке выпадают в осадок, в этом случае для того, чтобы белок оставался в растворе в гель вводится мочевина; при использовании мочевины следует применять только свежие её растворы, чтобы не допустить карбамоилирования белка;

• использование альтернативных способов окрашивания;

• использования добавок для геля, таких как неионные детергенты (например, октилглюкозид) или цвиттерионные детергенты (например, CHAPS или CHAPSO), и добавление амфолита к образцу для предотвращения процессов агрегации и преципитации белков.

ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ СЛЕДУЕТ ПРИНИМАТЬ ВО ВНИМАНИЕ, ИСПОЛЬЗУЯ

ДАННЫЙ МЕТОД

Образцы могут наноситься на любой участок поверхности геля, но для того, чтобы защитить белки от экстремальных величин рН, образцы не должны наносится в непосредственной близости от электродов. В ходе выполнения анализа аналитик может нанести белок на гель в трёх местах (посередине и на обоих концах). Образцы белка, наносимые на противоположные концы геля, могут быть различными.

Известно явление, называемое катодным дрейфом, при котором градиент рН с течением времени разрушается. Это может происходить, если фокусирование в геле происходит слишком долго. Причины данного явления не совсем ясны, но факторами, вызывающими катодный дрейф, могут быть электроэндоосмос и абсорбция диоксида углерода. Для исследования этой проблемы могут быть использованы фиксированные градиенты рН.

В течение фокусирования важно проводить эффективное охлаждение (приблизительно 4°C) ёмкости, в которую помещён гель. Высокие напряжённости электрического поля, используемые во время изоэлектрического фокусирования, могут приводить к перегреванию и влиять на качество фокусируемого геля.

2.3. ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)