2.7.19. Количественное определение фактора свертывания крови х

Количественное определение фактора свертывания крови Х производят по его специфической активации с образованием фактора Ха. Фактор Ха оценивают на основании его активности по расщеплению специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность фактора Х в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови Х. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора Х и ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между активностью фактора Ха и расщеплением хромогенного субстрата.

РЕАГЕНТЫ

Специфический активатор фактора Х из яда цепочной гадюки (RVV). Белок, полученный из яда цепочной гадюки (Vipera russelli), который специфически активирует фактор Х. Восстанавливают в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный препарат хранят при 4⁰С и используют в течение 1 месяца.

Хромогенный субстрат фактора Хa. Специфический хромогенный субстрат для фактора Ха, например: Л-а-бензилоксикарбонил^-аргинил^-глицил^-аргинина 4-нитроанилида дигидрохлорид, Л-бензоил^-изолейцил^-глутамил-глицил^-аргинина 4-нитроанилида гидрохлорид, метансульфонил^-лейцил-глицил^-аргинина 4-нитроанилид, метоксикарбонил^-циклогексилаланил-глицил^-аргинина 4-нитроанилида ацетат. Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор, содержащий 3,7 г/л трис-(гидроксиметил)-аминометана R, 2,1 г/л имидазола R, 0,02 г/л гексадиметрина бромида R и 1 г/л бычьего альбумина R или человеческого альбумина R. При необходимости доводят значение рН до 8,4 с использованием хлористоводородной кислоты R.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Все растворы перед испытанием быстро нагревают на водяной бане до 37⁰С.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета, поддерживаемого при 37⁰С. По 12,5 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл RVV и инкубируют в точности 90 секунд. К содержимому каждой ячейки добавляют 150 мкл хромогенного субстрата фактора Ха, разбавленного в соотношении 1:6 буфером для разведений.

Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость изменения оптической плотности (АА/мин). При невозможности непрерывной регистрации, оптическую плотность при 405 нм регистрируют с подходящими последовательными интервалами, например, продолжительностью 40 секунд, строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение АА/мин. Из значений АА/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность определения с использованием обычных статистических методов (5.3).