7.1 Валидация системы для количественного определения методом

ПЦР.

Программа валидации должна включать валидацию оборудования и ис­пользуемого метода ПЦР. Следует учитывать положения, изложенные в руково­дстве ICH (тема Q2B) «Валидация аналитического метода: методология».

Для валидации ПЦР-испытания обязательным является применение официальных рабочих стандартных образцов или стандартных препаратов внутреннего применения, калиброванных относительно Международных Стан­дартов, для последовательностей-мишеней, для определения которых систе­ма будет использоваться.

При валидации должно быть определено положительное граничное значе­ние. Положительное граничное значение определяется как минимальное количе­ство последовательностей-мишеней в объеме образца, которые могут быть опре­делены в 95% испытаний. Положительное граничное значение зависит от таких взаимосвязанных факторов, как объем экстрагированного образца и эффектив­ность методологии экстракции, транскрипция РНК-мишени в cDNA, процесс ам­плификации и детекции.

При определении предела детекции системы следует учитывать положи­тельные граничные значения для каждой последовательности-мишени и резуль­таты проведения испытания выше и ниже этих значений.

7.2. Контроль качества реагентов.

Все реагенты, имеющие критическое значение для используемой методоло­гии, должны проходить контроль перед использованием в рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность основывается на заранее определенных кри­териях качества.

Праймеры являются важнейшими компонентами ПЦР-анализа, и поэтому следует уделять особое внимание их строению, чистоте и валидации для ПЦР-анализов. Каждая новая партия праймеров перед введением в испытание должна быть испытана на специфичность, эффективность амплификации и отсутствие ин-гибирующих примесей. Праймеры могут быть подвергнуты модификации (напри­мер, связыванием с флуорофором или антигеном) для проведения детекции ам-пликона специфическими методами при условии, что такие модификации не при­ведут к ингибированию правильного и эффективного протекания процесса ам­плификации последовательности-мишени.

7.3. Контроль хода испытания.

7.3.1. Внешние контроли.

Для минимизации риска загрязнения и обеспечения адекватной чувствитель­ности в состав каждого ПЦР-испытания вводят следующие внешние контроли:

- положительный контроль: в нем содержится определенное количество копий последовательности-мишени; количество копий определяется индивидуально для каждой системы и кратно положительному граничному значению данной системы;

- отрицательный контроль: образец аналогичного основного состава, для кото­рого доказано отсутствие последовательностей-мишеней.

7.3.2. Внутренний контроль.

Внутренние контроли представляют собой определенные последовательности нуклеиновых кислот, содержащие сайты связывания с праймерами. Внутренние контроли должны амплифицироваться так же эффективно, как и испытуемая по­следовательность-мишень, но ампликоны должны иметь четкие отличия. Тип нук­леиновой кислоты (ДНК/РНК), используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же, что и в испытуемом материале. Внутренний контроль пред­почтительно добавлять к испытуемому материалу до выделения нуклеиновой ки­слоты; при этом он может использоваться для общего контроля процесса (экс­тракция, обратная транскрипция, амплификация, детекция).