2.7.4. Количественное определение фактора свертывания крови VIII

Количественное определение фактора свертывания крови VIII производят по его биологической активности в качестве кофактора активации фактора Х активированным фактором IX (фактором 1Ха) в присутствии ионов кальция и фосфолипидов. Активность препарата фактора VIII оценивают путем сравнения количества, необходимого для достижения определенной скорости образования фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для получения такой же скорости образования фактора Ха.

За Международную Единицу принимают активность фактора VIII в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

VIII. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческий фактор свертывания крови VIII BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: зависящая от фактора VIII активация фактора Х в реагенте факторов свертывания, состоящем из очищенных компонентов, и ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора VIII. Содержание метода количественного определения описывается следующей схемой:

(активированный) фактор VIII

1-я стадия Фактор X *- Фактор Ха

Фактор 1Ха, фосфолипид, Са²+

Фактор Ха

2-я стадия хромогенный субстрат »- пептид + хромофор

В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям. Отклонения от этого описания допустимы при условии, что с использованием в качестве препарата сравнения Международного Стандарта концентрата человеческого фактора свертывания крови VIII показано отсутствие существенных различий в результатах.

Коммерчески доступные наборы для количественного определения следует использовать в соответствии с инструкциями изготовителя; важно убедиться в том, что используемый набор подходит для данного количественного определения.

РЕАГЕНТЫ

Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого или говяжьего происхождения, включающих фактор Х, фактор IXa и активатор фактора VIII, обычно тромбин. Эти белки подвергнуты частичной очистке, предпочтительно, не менее чем до 50%, и не должны содержать примесей, мешающих активации фактора VIII или фактора Х. Фактор Х содержится в количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения, находящейся в пределах 10-350 нмоль/л, предпочтительно 15-30 нмоль/л. Фактор IXa готовят активацией очищенного фактора IX с использованием фактора XIa и получением фактора IXab и дальнейшей очисткой фактора IXab из реакционной смеси. Его окончательная концентрация в процессе образования фактора Ха должна составлять менее 30% от концентрации фактора Х, обычно 1-100 нмоль/л, предпочтительно 1-10 нмоль/л. Тромбин может присутствовать в форме его предшественника - протромбина, при условии, что его активация в реагенте протекает с достаточной скоростью для практически мгновенной и полной активации в эксперименте фактора VIII. Фосфолипиды могут быть получены из природных источников, например, из головного или спинного мозга крупного рогатого скота, соевого экстракта или синтетическим путем, и должны состоять в существенной степени (обычно от 15 до 35%) из фосфатидилсеринов. Окончательная концентрация фосфолипида в процессе образования фактора Ха должна составлять 1-50 мкмоль/л, предпочтительно 10-35 мкмоль/л. Реагент содержит ионы кальция в количестве, приводящем к окончательной концентрации 5-15 ммоль/л. Образование конечного фактора Ха проводят в растворе, содержащем не менее 1 мг/мл человеческого или бычьего альбумина, соответствующим образом буферизированного до рН 7,3-8,0. Компоненты реагента обычно разделяют не менее чем на два отдельных реагента, каждый из которых не обладает способностью самостоятельно генерировать фактор Ха. После восстановления реагенты могут быть объединены при условии, что в отсутствии фактора VIII не происходит образования существенных количеств фактора Ха. В окончательной инкубационной смеси фактор VIII должен быть единственным компонентом, лимитирующим скорость.

Вторая стадия включает количественное определение образовавшегося фактора Ха с использованием специфичного в отношении фактора Ха хромогенного субстрата. Обычно он представляет собой производное короткого пептида, состоящего из 3-5 аминокислотных остатков, соединенное с хромофорной группой. При отщеплении этой группы от пептидного субстрата ее хромофорные свойства смещаются к длине волны, при которой становится возможным произвести спектрофотометрическое определение. Субстрат обычно растворяют в воде и используют в концентрациях 0,2-2 ммоль/л. Субстрат также может содержать подходящие ингибиторы для прекращения дальнейшего образования фактора Ха и супрессирования активности тромбина, что улучшает селективность метода в отношении фактора Ха.

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Восстанавливают полное содержимое одной ампулы препарата сравнения и испытуемого препарата путем добавления подходящего количества воды R; используют немедленно. К восстановленным препаратам добавляют прерастворитель в количестве, достаточном для получения растворов с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл.

Прерастворитель представляет собой плазму, собранную у пациента, страдающего острой гемофилией А, или искусственно приготовленный реагент, который приводит к получению результатов, существенно не отличающихся от результатов, получаемых при использовании гемофилической плазмы и аналогичных испытуемых и стандартных образцов. Полученные материалы предварительного растворения должны быть стабильны в течение времени, необходимого для проведения определения, т.е. не менее 30 минут при 20⁰С. Их следует использовать в течение 15 минут.

Готовят дальнейшие разведения испытуемого и стандартного препаратов с использованием изотонического нехелатирующего буфера, содержащего 1% человеческого или бычьего альбумина и, например, трис-(гидроксиметил)-аминометан или имидазол, предпочтительно буферизированного при рН от 7,3 до 8,0. Готовят не менее трех отдельных, независимых разведений каждого препарата. Предпочтительно каждое из разведений готовить в двух повторностях. Разведения готовят таким образом, чтобы окончательная концентрация фактора VIII на стадии образования фактора Ха была ниже 0,03 МЕ/мл, предпочтительно ниже 0,01 МЕ/мл.

Готовят контрольный раствор, включающий все компоненты, кроме фактора

VIII.

Все разведения готовят в пластиковых пробирках и используют незамедлительно.

1. я стадия. Предварительно нагретые разведения образца сравнения фактора VIII и испытуемого препарата смешивают с соответствующим объемом предварительно нагретого реагента факторов свертывания крови или со смесью реагентов, его составляющих, и инкубируют смесь в пластиковых пробирках или ячейках планшета при температуре 37⁰С. Концентрации компонентов в процессе образования фактора Ха должны соответствовать спецификациям, приведенным выше при описании реагентов. Активацию фактора Х проводят в течение подходящего промежутка времени, предпочтительно прерывая реакцию до достижения концентрацией фактора Ха ее максимального уровня с целью получения удовлетворительной линейной зависимости отклика от дозы. Время активации выбирается также таким образом, чтобы достичь линейного во времени образования фактора Ха. Подходящие периоды активации обычно находятся в пределах от 2 до 5 минут, но допускаются и другие значения, при условии получения таким образом лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

1. я стадия. Активацию прерывают добавлением предварительно нагретого реагента, содержащего хромогенный субстрат. Проводят количественную оценку скорости расщепления субстрата, которая должна находиться в линейной зависимости от концентрации образовавшегося фактора Ха, измеряя изменение оптической плотности при соответствующей длине волны с помощью спектрофотометра. Оптическую плотность отслеживают постоянно, получая таким образом возможность вычислить начальную скорость расщепления субстрата, либо прерывают реакцию гидролиза по окончании подходящего промежутка времени путем понижения рН добавлением подходящего реагента, например, уксусной кислоты (50 объемных процентов С2Н4О2) или раствора цитрата (1 моль/л) с рН 3. Время гидролиза регулируют с целью достижения линейного характера образования хромофора во времени. Подходящими обычно являются периоды гидролиза от 3 до 15 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).