2.7.5. Количественное определение гепарина

Антикоагулянтную активность гепарина определяют in vitro путем сравнения его способности в заданных условиях замедлять свертывание обогащенной кальцием и цитратом овечьей плазмы с аналогичной способностью препарата сравнения гепарина, калиброванного в Международных Единицах.

Международная Единица (МЕ) - активность, проявляемая установленным количеством Международного стандарта, состоящего из высушенной из замороженного состояния натриевой соли гепарина, полученной из свиных кишечных слизистых оболочек. Эквивалент Международного стандарта в МЕ устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP калибруют в МЕ по сравнению с Международным стандартом с использованием изложенной ниже методики количественного определения.

Количественное определение выполняют одним из следующих методов установления начала свертывания с использованием пробирок и другого оборудования, соответствующего выбранному методу:

1. прямое визуальное наблюдение, предпочтительно, в отраженном свете на черном матовом фоне;

2. спектрофотометрическая регистрация изменения оптической плотности при длине волны около 600 нм;

c) визуальная фиксация изменения текучести путем производимого вручную опрокидывания пробирок;

d) механическая запись изменения текучести, определяемого по перемешиванию, с соблюдением мер предосторожности, направленных на минимизацию возмущений раствора в начальной стадии свертывания.

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Приведенные в тексте объемы являются примерными и могут быть адаптированы к используемой аппаратуре при условии соблюдения соотношений между различными объемами.

Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP разбавляют раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л до получения точно известного количества МЕ в миллилитре, и готовят аналогичный раствор испытуемого препарата, для которого ожидается такая же активность. Используя раствор натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, из каждого раствора готовят ряд разведений в геометрической прогрессии так, чтобы время свертывания, получаемое для низшей концентрации, не менее чем в 1,5 раза превышало время в контрольном опыте, а время свертывания, получаемое для высшей концентрации, давало значение, приводящее к построению удовлетворительной логарифмической кривой зависимости отклика от дозы, что определяется в ходе предварительного испытания.

Помещают двенадцать пробирок в баню с ледяной водой. Помечают их следующим образом: два ряда (Т1, Т2, Т3) для разведений испытуемого препарата и два ряда (S₁, S₂, S₃) для разведений препарата сравнения. В каждую из пробирок помещают по 1,0 мл размороженного субстрата плазмы R1 и 1,0 мл соответствующего разведения испытуемого препарата или препарата сравнения.

После каждого из добавлений производят перемешивание, не допуская образования пузырьков. Для дальнейших манипуляций пробирки отбирают в порядке: S1, S2, S3, Т1, Т2, Т3. Каждую из пробирок приблизительно на 15 минут помещают в водяную баню, нагретую до температуры 37⁰С, и добавляют к каждой из них 1 мл разведения цефалина R, к которому был добавлен соответствующий активатор, например, каолин, таким образом, чтобы время контрольного опыта было подходящим и не превышало 60 секунд. При использовании каолина непосредственно перед проведением испытания готовят смесь равных объемов цефалина R и суспензии легкого каолина R с его содержанием 4 г/л в растворе натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Ровно через 2 минуты добавляют 1 мл раствора кальция хлорида R концентрацией 3,7 г/л и регистрируют в качестве времени свертывания интервал, в секундах, между последним добавлением и началом свертывания, определяемым с помощью выбранного метода. В начале и в конце процедуры аналогичным образом определяют время контрольного опыта, используя вместо одного из разбавлений гепарина 1 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л; два полученных контрольных значения не должны существенно различаться. Времена свертывания переводят в логарифмы, используя средние значения для дублирующихся пробирок. Процедуру повторяют со свежими разведениями, проводя инкубации в порядке: Т1, Т2, Т3, S1, S2, S3. Результаты вычисляют с использованием обычных статистических методов.

Проводят не менее трех независимых определений. Для каждого из таких определений готовят свежие растворы препарата сравнения и испытуемого препарата, и используют новую свежеразмороженную порцию субстрата плазмы.

Активность испытуемого препарата вычисляют путем комбинирования результатов этих определений с использованием обычных статистических методов. Если отклонение, вызванное различиями между результатами определений, является значительным при Р = 0,01, комбинированная оценка активности может быть получена путем вычисления простого среднего значения оценок активности.

# Количественное определение гепарина в субстанции и готовых лекарственных формах может быть выполнено с использованием реакции антикоагуляции в соответствии с нижеизложенным методом.

Антикоагулянтная активность. Определение активности гепарина проводят биологическим методом по способности его задерживать свертывание нитратной бараньей или бычьей плазмы, путем сопоставления активности испытуемого препарата с активностью гепарина - стандартного образца.

В два ряда тщательно вымытых и высушенных пробирок вносят возрастающее количество рабочих растворов стандартного образца гепарина, испытуемого препарата гепарина и раствора натрия хлорида изотонического 0,9 % в количествах, указанных в таблице. После этого в каждую пробирку прибавляют по 1 мл плазмы, затем по 0,2 мл рабочего раствора кальция хлорида (попеременно в пробирки из ряда с раствором стандартного образца гепарина и испытуемого препарата гепарина), смешивают содержимое осторожно, поворачиванием и легким встряхиванием, не допуская образования пузырей, отмечают время и оставляют при комнатной температуре (или в термостате при температуре 37°С) на 1 ч. По истечении указанного времени определяют состояние плазмы в каждой пробирке и отмечают в каждом ряду крайнюю слева пробирку, в которой не произошло полное свертывание плазмы.

Эти пробирки содержат наименьшие объемы растворов стандартного образца гепарина и испытуемого препарата гепарина, которые задерживают свертывание плазмы.

	Порядок внесения раствора
Наименование раствора	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Раствор гепарина, мл	0,30	0,35	0,40	0,45	0,50	0,55	0,60	0,65	0,70	0,75	0,80
Раствор натрия хлорида изотонический 0,9 %, мл	0,50	0,45	0,40	0,35	0,30	0,25	0,20	0,15	0,10	0,05	-

Антикоагулянтную активность (Х) препарата, в ЕД/мл, вычисляют по формуле:

X = — ■ A ,

где

V1 - наименьший объем раствора стандартного образца гепарина, задерживающий свертывание плазмы, в миллилитрах;

V2 - наименьший объем испытуемого раствора гепарина, задерживающий свертывание плазмы, в миллилитрах;

А - предполагаемая активность.

Определение проводят не менее трех раз и берут средний результат. Примечания:

1. Приготовление 8 % раствора натрия цитрата. 8 г натрия цитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

2. Приготовление 10 % раствора кальция хлорида. 10 г кальция хлорида безводного помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок годности раствора 1 месяц при температуре от 0 до +4°С.

3. Приготовление плазмы. Кровь, вытекающую из сосудов убойного животного, собирают в банки из полиэтилена вместимостью 1 л, содержащие от 25 до 30 мл 8 % раствора натрия цитрата.

Кровь осторожно смешивают с 8 % раствором натрия цитрата, поворачивая баню, и как можно быстрее центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 минут, после чего плазму отсасывают.

Плазму хранят в замороженном состоянии при температуре от -10 до -20°С во флаконах вместимостью от 50 до 150 мл, избегая ее оттаивания.

Перед употреблением плазму размораживают на водяной бане или термостате при температуре 37 ± 0,5°С. Затем плазму фильтруют через марлю, проверяют время ее свертывания и оценивают оптимальное количество кальция хлорида, необходимое для определения активности: в 5 пробирок с 1 мл плазмы в каждой прибавляют возрастающие количества 10 % раствора кальция хлорида (0,02

• 0,04 - 0,06 - 0,08 -0,10 мл) и осторожно смешивают. Для опыта используют плазму, время свертывания которой не превышает 10 минут и то оптимальное количество кальция хлорида, которое вызывает полное свертывание плазмы в указанное время. Найденное оптимальное количество кальция хлорида должно содержаться в 0,2 мл рабочего раствора (этот раствор готовят разведением 10 % раствора кальция хлорида). Срок годности плазмы 1 год при температуре от - 10 до -20°С.

4. Приготовление раствора стандартного образца гепарина. Навеску гепарина

• стандартного образца растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9 % с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 50 ЕД.

Срок годности раствора 6 месяцев при температуре от 0° С до +4 °С.

Предварительно из гепарина - стандартного образца готовят растворы, содержащие в 1 мл 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ЕД. По 0,5 и 0,72 мл полученных растворов помещают в пробирки, доводят объем раствора в пробирке до 0,8 мл раствором натрия хлорида изотоническим 0,9 %. Затем прибавляют по 1 мл плазмы и 0,2 мл кальция хлорида оптимальной концентрации и перемешивают.

Через 1 час определяют состояние плазмы в каждой пробирке и устанавливают активность раствора гепарина - стандартного образца, при которой в пробирке, содержащей 0,5 мл раствора гепарина, происходит полное свертывание плазмы, а в другой пробирке, содержащей 0,72 мл этого раствора гепарина, плазма не свернулась. Выбранная активность обеспечивает наблюдение за влиянием испытуемого гепарина - стандартного образца на свертывание плазмы по истечении часа. Обычно эта активность находится в пределах 1 - 1,5 ЕД для плазмы КРС и 1 -3,5 ЕД для бараньей плазмы.

5. Приготовление раствора испытуемого препарата. Навеску препарата растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9%, исходя из его предполагаемой активности с таким расчетом, чтобы 1 мл полученного раствора содержал столько же единиц гепарина, сколько содержит 1 мл раствора гепарина -стандартного образца. Раствор используют свежеприготовленным.

6. При необходимости разрешается сдвигать ряд пробирок, указанный в таблице, в сторону уменьшения концентрации раствора гепарина.