2.6.22. Активированные факторы свертывания крови

При необходимости определяют количество присутствующего гепарина (2.7.12) и нейтрализуют его добавлением протамина сульфата R (10 мкг прота-мина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Готовят разбавления испытуемого препарата в соотношениях 1:10 и 1:100 с использованием трис-(гидроксиметил)-аминометанового буферного раствора рН 7,5 R. Ряд пробирок из полистирола помещают в водяную баню с температурой 37⁰С и добавляют к каждой из проби­рок по 0,1 мл плазмы с пониженным содержанием тромбоцитов R и по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или заменителя тромбоцитов R. Выдер­

живают в течение 60 секунд. К каждой пробирке добавляют либо 0,1 мл одного из разведений, либо 0,1 мл буферного раствора (контрольная пробирка). К содержи­мому каждой пробирки немедленно добавляют 0,1 мл предварительно нагретого до 37⁰С раствора кальция хлорида R концентрацией 3,7 г/л и в течение 30 минут от момента первоначального разведения измеряют время между добавлением раствора хлорида кальция и формированием сгустка. Результаты считают досто­верными, если время коагуляции в контрольной пробирке составило от 200 до 350 секунд.

2.7 Биологические методы количественного определения

2.7.1. Иммунохимические методы

Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом нековалентном связывании антигенов антителами. Эти методы используются для обнаружения и количественного определения как антигенов, так и антител. Факт образования комплекса антигена с антителом и количество этого комплекса могут быть определены различными путями. Положения данного общего метода относятся к иммунохимическим методам с использованием меченых или немеченых реагентов.

Результаты, получаемые иммунохимическими методами, зависят от реакционных условий, а также природы и качества используемых реагентов. Важно стандартизировать компоненты, используемые в ходе иммуноанализа и, по возможности, использовать для количественных определений международные стандартные препараты.

Реагенты, необходимые для многих иммунохимических методов, содержатся в составе коммерчески доступных наборов, т.е. наборов, включающих реагенты (антигены или антитела) и материалы, предназначенные для оценки in vitro указанной субстанции, а также инструкции по их надлежащему применению. Наборы используются в соответствии с инструкциями производителя; важно убедиться в том, что наборы являются подходящими для анализа испытуемой субстанции с особым учетом их селективности и чувствительности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

В методах с использованием меченых веществ могут применяться подходящие метки, например, ферменты, флуорофоры, люминофоры и радиоизотопы. Если меткой является радиоизотоп, метод называют «радиоиммунологическим анализом». Рекомендации по измерению радиоактивности, приведенные в статье «Радиофармацевтические препараты (0125)», подходят также и для иммунологических анализов с использованием радиоизотопов. Работа с радиоактивными материалами должна выполняться в соответствии с национальным законодательством и международными документами по защите от радиационной опасности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА Методы иммунопреципитации

Методы иммунопреципитации включают процессы флокуляции и осаждения. При смешивании растворов антигена с соответствующим антителом в подходящих условиях реактанты образуют флокулирующие или преципитационные агрегаты. Отношение реактантов, при котором достигается минимальное время флокуляции или наиболее заметное осаждение, называют оптимальным отношением. Такое отношение обычно составляют эквивалентные количества антигенов и антител. Иммунопреципитация может оцениваться визуально или по светорассеянию (нефелометрическое и турбидиметрическое определение). Увеличение чувствительности может быть достигнуто использованием в качестве реактантов частиц (например, из латекса), покрытых антигенами или антителами.

В методах флокуляции обычно используют ступенчатые разбавления одного из реактантов, в то время, как в иммунодиффузионных (ИД) методах разбавление достигается путем диффузии в гелеобразную среду: достигаются концентрационные градиенты одного из реактантов или обоих. Таким образом, в геле образуются зоны, в которых отношение реактантов способствует преципитации. В то время как флокуляционные методы выполняются в пробирках, в иммунодиффузионных методах используются различные носители: пробирки, пластины, стекла, ячейки или камеры.

Если система иммунопреципитации состоит из одного антигена в комбинации с соответствующим антителом, система определяется как простая; если в ней участвуют родственные, но серологически неидентичные реактанты, система является сложной, а если в ней участвуют несколько серологически не связанных друг с другом реактантов, ее называют комплексной.

В методах простой диффузии концентрационный градиент устанавливается только для одного из реактантов, диффундирующего из внешнего источника в гелевую среду, содержащую соответствующий реактант в относительно низкой концентрации.

Простая радиальная иммунодиффузия (ПРИД) представляет собой простой количественный иммуодиффузионный метод. При достижении равновесия между внешним и внутренним реактантами круговая область преципитации, начинающаяся от места локализации внешнего реактанта, прямо пропорциональна количеству нанесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антитела в геле.

В двойных диффузионных методах концентрационные градиенты устанавливаются для обоих реактантов. И антиген, и антитело диффундируют из различных участков в гель, который первоначально был иммунологически нейтральным.

Сравнительные методы двойной диффузии используются для количественного сравнения различных антигенов против подходящих антител или наоборот. Сравнение основано на наличии или отсутствии взаимодействия между образцами преципитации. Могут быть выделены реакции идентичности, неидентичности и частичной идентичности антигенов или антител.

Иммуноэлектрофоретические методы

Иммуноэлектрофорез (ИЭ) - качественный метод, сочетающий две процедуры: гель-электрофорез с последующей иммунодиффузией.

Перекрестный иммуноэлектрофорез представляет собой модификацию метода ИЭ и является подходящим как для качественного, так и для количественного анализа. Первая часть процедуры представляет собой обычный гель-электрофорез. По ее окончании протяженную полосу геля, содержащую разделенные фракции, подлежащие определению, вырезают и переносят на другую пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно предыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем относительно небольшую концентрацию антитела, соответствующего используемому антигену. Зависимость площади соответствующих пиков преципитации от количества соответствующего антигена является линейной для данной концентрации антитела и толщины геля.

Электроиммунный анализ, часто называемый ракетным иммуноэлектрофорезом представляет собой быстрый метод количественного определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот.

Выполняют электрофорез антигена, подлежащего определению, в геле, содержащем относительно низкую концентрацию соответствующих антител. Испытуемый материал и разведения стандартного антигена, используемые для калибровки, вносят в разные лунки в геле. В процессе электрофореза появляются мигрирующие пикообразные зоны преципитации, начинающиеся от лунок. Фронт преципитации становится неподвижным, когда количество антигена перестает быть избыточным. Зависимость расстояния, пройденного фронтом преципитации, от количества нанесенного антигена является линейной для данной концентрации антител.

Обратный иммуноэлектрофорез представляет собой быстрый метод количественного определения, позволяющий устанавливать концентрационные градиенты внешних антител и антигенов в электрическом поле в зависимости от разницы зарядов. Разведения стандарта для калибровки и разведения испытуемого материала вносят в ряд лунок в геле, а в противоположный ряд лунок вносят фиксированное количество соответствующего реактанта. Титр испытуемого материала может быть определен как максимальное разведение, для которого наблюдается линия преципитации.

Существует ряд модификаций методов перекрестного иммуноэлектрофореза и электроиммунного анализа.

В других методах сочетается разделение антигенов по размеру молекул и серологическим свойствам.

Визуализация и характеризация линий иммунопреципитации.

Эти операции могут быть выполнены с использованием селективных или неселективных красителей, по флуоресценции, введением ферментных или изотопных меток или другими подходящими методами. Для характеризации в преципитатах веществ небелковой природы обычно используют методы селективного окрашивания.

В полупрозрачных гелях, например, на основе агара или агарозы, линии осаждения четко различимы визуально при условии наличия достаточной концентрации каждого из реактантов.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА

Критерии валидации

Количественный иммунохимический метод является достоверным при выполнении следующих условий:

1. Антитела и антигены не имеют существенных отличий в стандартном и испытуемом образце. В случае меченых реактантов, различия меченого и немеченого компонента соответствующего реактанта должны быть незначительными.

2. На результат не должна оказывать влияния матрица, т.е. любой компонент испытуемого образца или используемые вспомогательные вещества, которые могут отличаться в разных образцах. В образцах могут содержаться высокие концентрации посторонних белков, солей, консервантов или веществ, обладающих протеолитической активностью.

3. Предел количественного определения должен быть ниже критерия, установленного в частной статье.

1. Точность определения должна быть достаточной для выполнения требований, предъявляемых в частных статьях.

2. Порядок, в котором проводится определение, не приводит к увеличению системных ошибок.

Методы валидации

Для проверки выполнения этих критериев разрабатывается процесс валидации, включающий следующие элементы:

1. Испытание выполняют не менее чем в трех повторностях.

2. Испытание проводят не менее чем для трех различных разведений препарата сравнения и трех разведений испытуемых препаратов, предполагаемая активность которых равна активности стандартного образца.

3. Используют рандомизированную схему количественного определения.

4. Если испытуемый препарат находится в сыворотке или в смеси с иными компонентами, стандарт должен быть приготовлен аналогичным образом.

5. Испытание должно включать измерение неспецифического связывания меченого реактанта.

6. В случае заместительного иммунного анализа:

а) определяют максимальное связывание (нулевое замещение),

б) разведения должны охватывать весь диапазон откликов от значений, близких к неспецифическому связыванию, до максимального связывания, предпочтительно, как для стандартного, так и для испытуемого препарата.

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ВЫЧИСЛЕНИЯ

Кривые откликов, полученные для испытуемого и стандартного препаратов, могут быть проанализированы с использованием методов, описанных в разделе 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений.

Существенная степень непараллельности указывает на то, что между антителом и антигеном в испытуемом и стандартном образцах имеются различия, и результаты испытания являются недостоверными.

В заместительных иммунологических количественных определениях не должно быть существенных различий между значениями неспецифического связывания и максимального замещения при высокой концентрации испытуемого образца и стандарта. Различия могут указывать на наличие эффектов, связанных с матрицей: ингибированием связывания либо разложением метки.