2.7.13. Количественное определение человеческого анти-d-иммуноглобулина

МЕТОД А

Активность человеческого анти-й-иммуноглобулина определяют путем сравнения количества препарата, необходимого для агглютинации D-положительных эритроцитов с количеством препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, необходимым для получения того же эффекта.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-й-иммуноглобулина BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-й-иммуноглобулина.

Используют пул D-положительных эритроцитов, собранных не более чем за 7 дней до испытания, хранившихся соответствующим образом и полученных не менее чем от четырех групп доноров с группой 0 R₁R₁. К подходящему объему клеток, предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, добавляют равный объем раствора бромелайна R, выдерживают при 37⁰С в течение 10 минут, центрифугируют, отделяют супернатант и промывают трижды раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. 20 объемов эритроцитов суспендируют в смеси 15 объемов инертной сыворотки, 20 объемов раствора бычьего альбумина R концентрацией 300 г/л и 45 объемов раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Полученную суспензию охлаждают ледяной водой при постоянном перемешивании.

С использованием калиброванного автоматического прибора для разведения и раствора для разведений, содержащего 5 г/л бычьего альбумина R и 9 г/л натрия хлорида R, готовят подходящие разведения испытуемого препарата и препарата сравнения.

Определение обычно проводят по изложенной ниже методике, используя соответствующий прибор для непрерывного автоматического гемолитического анализа. Температуру в трубопроводе, кроме инкубационных ячеек, поддерживают на уровне 15,0⁰С. Вводят с помощью насоса в трубопровод аппарата суспензию эритроцитов со скоростью 0,1 мл/мин и раствор метилцеллюлозы 450 R концентрацией 3 г/л со скоростью 0,05 мл/мин. В течение 2 минут со скоростью 0,1 мл/мин вводят разведения испытуемого препарата и препарата сравнения. Перед введением очередного разведения вводят в течение 4 минут со скоростью 0,1 мл/мин раствор для разведений.

Вводят воздух со скоростью 0,6 мл/мин. Инкубируют при 37⁰С в течение 18 минут, после чего рассеивают столбики эритроцитов путем введения со скоростью 1,6 мл/мин раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего подходящий увлажняющий агент (например, полисорбат 20 R в окончательной концентрации 0,2 г/л) для предотвращения разрушения аппликаций. После оседания агглютинатов дважды декантируют: вначале со скоростью 0,4 мл/мин, затем - со скоростью 0,6 мл/мин. Эритроциты, не подвергшиеся агглютинации, лизируют раствором, содержащим 5 г/л октоксинола 10 R, 0,2 г/л калия феррицианида R, 1 г/л натрия гидрокарбоната R и 0,05 г/л калия цианида R и подаваемым со скоростью 2,5 мл/мин. Система включает петлю для получения десятиминутной задержки, необходимой для конверсии гемоглобина. Оптическую плотность (2.2.25) гемолизата регистрируют непрерывно при длине волны, выбранной в интервале от 540 до 550 нм. Определяют диапазон концентраций антител, на протяжении которого существует линейная зависимость между концентрацией и полученным изменением оптической плотности (ДА). Исходя из полученных результатов, строят градуировочную кривую, участок линейности которой используют для определения активности испытуемого препарата.

Активность испытуемого препарата вычисляют с использованием обычных статистических методов (5.3).

МЕТОД В

Активность человеческого анти-й-иммуноглобулина определяют методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, производимого на титрационных микропланшетах, покрытых эритроцитами. Метод основан на конкурентном связывании между поликлональным препаратом анти-й-иммуноглобулина и биотинированными моноклональными анти-й-антителами, направленными против специфического эпитопа й-антигена. Активность испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-й-иммуноглобулина BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-й-иммуноглобулина.

МАТЕРИАЛЫ

Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.

СФБ (раствор хлорида натрия в фосфатном буфере). 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R растворяют в воде R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.

СТБ (раствор хлорида натрия в трис-буфере). 8,0 г натрия хлорида R и 0,6 г трис-(гидроксиметил)-аминометана R растворяют в воде R. Доводят значение рН до 7,2 (2.2.3) с помощью 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.

Раствор папаина. Раствор готовят перемешиванием при 37⁰С в течение 30 минут 1 г папаина R в 10 мл 0,0б7 М фосфатного буферного раствора рН 5,4 R, центрифугированием при 10000 g в течение 5 минут и фильтрованием через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл фильтрата, 1 мл раствора L-цистеина R концентрацией 48,44 г/л и 1 мл раствора натрия эдетата R концентрацией 3,72 г/л и разбавляют до 10 мл 0,067 М фосфатным буферным раствором рН 5,4 R. Аликвоты замораживают при температуре -20⁰С и ниже.

Эритроциты. Используют пул й-положительных эритроцитов, полученных не менее чем из трех групп доноров с группой 0 R1R1. Клетки промывают четырежды СФБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 минут, смешивают подходящий объем предварительно нагретых упакованных клеток с подходящим объемом предварительно нагретого раствора папаина (объемное соотношение 2:1 было найдено подходящим) и инкубируют при 37⁰С в течение 10 минут. Клетки промывают четырежды СФБ. Хранят при 4⁰С с подходящим стабилизатором не более недели.

Биотинированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкциями.

Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой. Предпочтительно использовать модифицированный реагент, сочетающий высокую специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания. Используют в соответствии с инструкциями.

Раствор субстрата. Используют в соответствии с инструкциями пара-нитрофенилфосфат.

Буфер для фиксации клеток. 18,02 г глюкозы R, 4,09 г натрия хлорида R, 1,24 г борной кислоты R, 10,29 г натрия цитрата R и 0,74 г натрия эдетата R растворяют в воде R. Доводят показатель рН (2.2.3) до 7,2-7,3 добавлением 1 М раствора натрия гидроксида или 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют водой R до 1000 мл. Хранят при температуре 4⁰С. Используют непосредственно из места хранения.

Раствор глутарового альдегида. Непосредственно перед применением 90 мкл раствора глутарового альдегида R концентрацией 250 г/л добавляют к 24 мл холодного СФБ.

Титрационные микропланшеты. Планшеты, предназначенные для покрытия эритроцитами, представляют собой плоскодонные планшеты из полистирола со свойствами поверхности, оптимизированными для иммуноферментного анализа и с большой емкостью в отношении связывания с белками. Планшеты, используемые для приготовления разведений иммуноглобулина, представляют собой планшеты из полистирола или поливинилхлорида с U- или V-образными формами ячеек.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Готовят 0,1% (по объему) суспензию обработанных папаином эритроцитов в холодном буфере для фиксации клеток. В каждую ячейку плоскодонного титрационного микропланшета помешают по 50 мкл суспензии.

Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 минут, предпочтительно, при 4⁰С. Не удаляя супернатант, к содержимому каждой из ячеек осторожно добавляют по 100 мкл раствора глутарового альдегида и выдерживают в течение 10 минут. Содержимое ячеек сливают путем быстрого переворачивания планшета и трижды промывают каждую ячейку 250-300 мкл СФБ. Эта операция может производиться либо вручную, либо с использованием автоматического устройства для промывания планшетов. Планшет либо используют в нижеописанном испытании, либо после сливания СФБ, добавления в каждую ячейку 100 мкл буфера для фиксации клеток и запечатывания пластиковой пленкой хранят при 4⁰С не более 1 месяца.

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.

Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R.

В ячейки каждого из рядов титрационного микропланшета с U- или V-образными формами ячеек вносят по 35 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения. К содержимому каждой из ячеек добавляют по 35 мкл биотинированного Brad-5 с содержанием 250 нг/мл.

Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем переворачивания и высушивания бумажным полотенцем. Добавляют по 250 мкл СФБ, содержащего 20 г/л бычьего альбумина R и оставляют при комнатной температуре на 30 минут.

Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем переворачивания и высушивания бумажным полотенцем и помещают в каждую из ячеек по 50 мкл каждого из разведений испытуемого раствора и раствора сравнения, содержащих биотинированный Brad-5. 50 мкл СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R, используют в качестве отрицательного контроля. Планшет запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую ячейку 250-300 мкл СТБ.

Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой, разбавляют СТБ, содержащим 10 г/л бычьего альбумина R и добавляют в количестве по 50 мкл в каждую из ячеек. Инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре.

Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую ячейку 250-300 мкл СТБ.

В каждую из ячеек добавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Для остановки реакции в каждую из ячеек добавляют по 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида.

Измеряют значения оптической плотности при длине волны 405 нм и вычитают значение, полученное для отрицательного контроля. Значения оптической плотности в области линейности кривой титрования используют для оценки активности испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (5.3).

МЕТОД С

Активность человеческого анти-й-иммуноглобулина определяют методом поточной цитометрии в формате титрационного микропланшета. Метод основан на специфическом связывании между анти-й-иммуноглобулином и В-положительными эритроцитами. Активность испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандартного Образца. Эквивалентность Международного Стандартного Образца в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-й-иммуноглобулина BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом и предназначен для использования в количественных определениях человеческого анти-й-иммуноглобулина.

МАТЕРИАЛЫ

Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.

СФБ. 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R растворяют в воде R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.

Раствор СФБ-БСА. СФБ, содержащий 10,0 г/л бычьего альбумина R.

Эритроциты. Используют й-положительные эритроциты, полученные из группы доноров с группой 0 R1R1 не более, чем за две недели до определения. При необходимости хранят с соответствующим стабилизатором при 4⁰С. Клетки промывают не менее двух раз раствором СФБ-БСА и готовят суспензию, содержащую 1х10⁴, но не более 5х10⁴ клеток в микролитре с использованием раствора СФБ-БСА.

Используют й-отрицательные эритроциты, полученные из группы доноров с группой 0 rr и подготовленные аналогичным образом.

Вторичные антитела. Используют подходящий фрагмент анти-!дО-антитела, связанный с флуоресцентным красителем, обладающий специфичностью в отношении человеческого IgG или его частей. Хранят и используют в соответствии с инструкциями изготовителя.

Титрационные микропланшеты. Используют плоскодонные планшеты без поверхностной обработки для иммуноферментного анализа.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не менее трех серийных полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2-0,15 МЕ/мл с использованием раствора СФБ-БСА. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.

Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не менее трех серийных полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2-0,15 МЕ/мл с использованием раствора СФБ-БСА. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.

В каждую ячейку титрационного микропланшета распределяют по 50 мкл й-положительных эритроцитов. К содержимому ячеек каждого ряда добавляют по 50 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения. Используют 50 мкл раствора СФБ-БСА в качестве отрицательного контроля. По 50 мкл й-отрицательных эритроцитов распределяют в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют по 50 мкл наименьшего разведения испытуемого препарата. Для отслеживания ложных реакций распределяют по 50 мкл й-положительных эритроцитов в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют по 50 мкл раствора СФБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при 37⁰С в течение 40 минут.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и промывают ячейки 200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют промывку еще не менее одного раза.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и добавляют по 50 мкл вторичного антитела, разбавленного раствором СФБ-БСА до подходящей концентрации белка. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 20 минут.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, отбрасывают супернатант и промывают ячейки 200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют промывку еще не менее одного раза.

Планшеты центрифугируют при 50 g в течение 3 минут, клетки ресуспендируют в 200-250 мкл раствора СФБ-БСА.

Суспензию клеток переносят в трубку, совместимую с имеющимся оборудованием для поточной цитометрии, и проводят дальнейшее разбавление добавлением СФБ для обеспечения подходящей скорости потока.

Немедленно приступают к измерению медианной интенсивности флуоресценции в поточном цитометре. Регистрируют не менее 10000 событий без гейтинга, но с исключением шумов.

С использованием медианной интенсивности флуоресценции в области линейности кривой зависимости отклика от дозы оценивают активность испытуемого препарата обычными статистическими методами (5.3).