2.6.13. Микробилогические испытания несте­рильной продукции (испытания на наличие спе­цифических микроорганизмов)

Методики, изложенные в данной статье, допускают использование селек­тивных питательных сред, которые не позволяют выделять микроорганизмы с сублетальными повреждениями. Так как для обеспечения качества лекарственно­го средства необходимо выявлять микроорганизмы с сублетальными поврежде­ниями, следует предусмотреть проведение процедуры восстановления их жизне­способности перед использованием селективных питательных сред.

Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, она должна быть соответствующим способом нейтрализована.

• Допускается использование автоматизированных методов испытаний, ес­ли в результате проверки пригодности было доказано, что они имеют результаты, идентичные описанным ниже методам. Для биохимической идентификации мик­роорганизмов могут быть использованы готовые тест-системы.

Энтеробактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии

Испытание предназначено для определения бактерий семейства Enterobac-teriaceae, но также позволяет определять и другие типы микроорганизмов (напри­мер, Aeromonas, Pseudomonas).

Определение наличия бактерий. Готовят испытуемый продукт в соответст­вии с указаниями, приведенными в разделе 2.6.12, но с использованием пита­тельного бульона D вместо буферизированного раствора хлорида натрия и пеп­тона рН 7,0, гомогенизируют и инкубируют при 35-37⁰С в течение промежутка времени, достаточного для оживления бактерий и недостаточного для иницииро­вания их размножения (обычно 2 часа, но не более 5 часов). Контейнер встряхи­вают, переносят количество содержимого [гомогенат (а)], соответствующее одно­му грамму или одному миллилитру продукта, в 100 мл обогащенного питательного бульона Е и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашки с агаризованной средой F. Инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-24 часов. Про­дукт выдерживает испытание, если ни на одной из чашек не наблюдается рост грамотрицательных бактерий.

• 10 мл испытуемого образца, подготовленного, как описано в разделе 2.6.12, но с использованием среды №11 вместо буферного раствора с натрия хлоридом и пептоном рН 7,0, вносят в 100 мл питательной среды № 3, перемеши­вают и инкубируют при температуре от 30 до 35°С в течение 24 - 48 ч. При нали­чии роста делают пересев на среду № 4 в чашке Петри. Посевы инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 ч. Наличие роста малиновых с металли­ческим блеском или без него; розовых, бесцветных, блестящих, выпуклых колоний грамотрицательных палочек указывает на возможное загрязнение лекарственного средства бактериями сем. Enterobacteriaceae и некоторыми другими грамотрица-тельными бактериями. Выросшие колонии пересевают, каждую отдельно, со сре­ды № 4 на скошенную в пробирках среду № 1 и выращивают при температуре 30 -35°С течение 18 - 20 ч. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы на среды № 6 и № 7.

После посева в половину пробирок со средой № 6 вносят по 0,5 мл сте­рильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 18 - 20 ч. Ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды № 6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии нит­ритов в среде № 7 судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса. Параллельно исследуют чистые культуры на наличие фермента цитохромоксидазы. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и восста­навливают нитраты в нитриты, лекарственное средство контаминировано бакте­риями семейства Enterobacteriaceae.

• Тест на цитохромоксидазу. Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом и наносят стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий со среды №1. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свиде­тельствует о положительной оксидазной реакции.

Количественная оценка. Инокулируют подходящие количества питательно­го бульона Е гомогенатом (а) и/или его разбавлениями, содержащими, соответст­венно, 0,1 г, 0,01 г и 0,001 г (или 0,1 мл, 0,01 мл и 0,001 мл) испытуемого продукта. Инкубируют при температуре 35-37⁰С в течение 24-48 часов. Каждую из культур пересевают на чашку с агаризованной средой F для достижения селективного разделения. Инкубируют при температуре 35-37⁰С в течение 18-24 часов. Рост хорошо развитых колоний грамотрицательных бактерий, обычно красной или красноватой окраски, представляет собой положительный результат. Отмечают наименьшее количество продукта, дающее положительный результат, и наи­большее количество, дающее отрицательный результат. Вероятное количество бактерий определяют по таблице 2.6.13.-1.

• Инокулируют подходящие количества среды №3 гомогенатом и /или его разбавлениями, содержащими, соответственно, 0,1 г, 0,01 г и 0,001 г (или 0,1 мл, 0,01 мл и 0,001 мл) испытуемого продукта. Инкубируют при температуре 30 - 35⁰С в течение 24 - 48 ч. При наличии роста делают пересев на плотную среду №4 (агар Эндо) и инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае по­явления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по Таблице 2.6.13.-1.

При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца В пропускают через стерильный мембранный фильтр, как описано в разделе 2.6.12., помещают мембрану в 100 мл обогащенной питательной среды Е и инкубируют при темпера­туре 35-37 ⁰С 18-24 часа. После окончания инкубации делают пересев на по­верхность агаризованной среды F для выявления энтеробактерий и других гра-мотрицательных микроорганизмов.

Escherichia coli

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела 2.6.12. 10 мл образца или количество, представляющее 1 г или 1 мл продукта, по­мещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-48 часов. Контейнер встряхивают, переносят 1 мл содержимого в 100 мл питательной среды G и инкубируют при 43-45⁰С в течение 18-24 часов. Пересевают на чашки с агаризованной средой H и инкубируют при 35-37⁰С в те­чение 18-72 часов. Рост красных, немукоидных колоний грамотрицательных пало­чек указывает на возможное присутствие E.coli. Для подтверждения проводят со­ответствующие биохимические тесты, например, по образованию индола. Продукт выдерживает испытание, если подобные колонии не обнаруживаются или под­тверждающие биохимические реакции дают отрицательный результат.

# 10 мл образца в питательной среде №11 или количество, представляю­щее 1 г или 1 мл продукта, подготовленное и инкубированное как описано в раз­деле «Энтеробактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии. Количе­ственная оценка», помещают в 100 мл питательной среды №3 и инкубируют при температуре 30-35⁰С в течение 18-24 часов Пересевают на среду № 4 и инкуби­руют при температуре 30 - 35°С в течение 18-24 часов. На среде № 4 E.coli обра­зуют, как правило, характерные малиновые колонии с металлическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli ко­лонии микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках плотную среду №1 и инкубируют при температуре 30 -35°С в течение 18-24 часов. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пере­севы на среды №14 (агар Симмонса) и №15 (бульон Хоттингера), а также исполь­зуют для теста на цитохромоксидазу. Через 18-24 часа инкубации при 30 - 35°С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах № 14 и № 15. Утили­зацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды №14 из зеленого в си­ний. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды № 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие па­лочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминиро-вано E. coli.

Salmonella

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела 2.6.12, но с использованием питательного бульона А вместо буферизированного раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0, гомогенизируют и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-24 часов. 1 мл обогащенной культуры переносят в 10 мл пита­тельного бульона I и инкубируют при 41-43⁰С в течение 18-24 часов. Пересевают не менее чем на две различные агаризованные среды, выбранные из агаризован-ных сред J, К и L. Инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-72 часов. На возможное присутствие сальмонелл указывает рост культур, имеющих следующие характер­ные признаки:

Агаризованная среда J: хорошо развитые бесцветные колонии.

Агаризованная среда К: хорошо развитые красные или красные с черным цен­тром колонии.

Агаризованная среда L: маленькие прозрачные бесцветные или обладающие

окраской от розовой до белой колонии, часто окружен­ные зоной розового или красного цвета.

Несколько подозрительных колоний переносят по отдельности на агаризо-ванную среду М в пробирках с использованием поверхностной и глубинной иноку­ляции. Присутствие сальмонелл предварительно подтверждается, если имеется изменение окраски из красной в желтую и, как правило, газообразование в случае глубинной, но не поверхностной инокуляции. При этом в агаре может образовы­ваться сероводород. Окончательный вывод делают на основе соответствующих биохимических и серологических испытаний. Продукт выдерживает испытание, если культура описанного типа не обнаруживается или подтверждающие биохи­мические и серологические испытания дают отрицательный результат.

# 1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл сре­ды № 12 (селенитовая среда) и инкубируют при 30 - 35°С в течение 16-18 часов. Делают пересев петлей на среду № 5 (висмут-сульфит агар) и инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 часов. На среде № 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозри­тельные на принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и, при обнару­жении в мазках грамотрицательных палочек, отсевают на среду №13 (трехсахар-ный агар с солями железа), нанося небольшое количество культуры петлей сна­чала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру с плотной среды № 1. Че­рез 18-24 часа инкубации при 30 - 35⁰С отмечают изменение цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды сви­детельствует об образовании сероводорода.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие па­лочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не ферментирующие саха­розу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

Pseudomonas aeruginosa

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела 2.6.12. 10 мл образца или количество, соответствующее 1 г или 1 мл продукта, помещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашки с агаризованной средой N и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-72 часов. Если рост микроорганизмов не на­блюдается, то продукт выдерживает испытание. Если имеется рост колоний гра-мотрицательных палочек, выполняют пересев некоторого количества различаю­щихся по морфологическим признакам изолированных колоний на питательный бульон А и инкубируют при 41-43⁰С в течение 18-24 часов. Продукт выдерживает испытание, если при 41-43⁰С роста не происходит.

При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А пропускают через стерильный мембранный фильтр в соответствии с указаниями общего раз­дела 2.6.12, помещают мембранный фильтр в 100 мл жидкой среды А и инкуби­руют при температуре 35-37⁰С в течение 18-48 часов. После окончания периода инкубации пересевают на поверхность агаризованной среды N.

# Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной среды № 8, перемешивают и инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 часов. Делают пересев на чашку с плотной питательной средой №9 и инкубируют при температуре 30-35⁰С от 18 до 48 часов. Рост зеленоватых, как правило, флюо­ресцирующих колоний, голубых в ультрафиолетовом свете (что свидетельствует о наличии пигмента пиоцианина) указывает на возможность загрязнения лекарст­венного средства Pseudomonas aeruginosa. В этом случае подозрительные коло­нии пересевают на скошенную плотную среду №1, инкубируют при температуре 30-35⁰С в течение 18-24 часов. Выросшие колонии микроскопируют и, при выяв­лении грамотрицательных палочек, проводят тест на наличие фермента цитохро-моксидаза. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию и образуют сине-зеленый пигмент, лекарственное средство контаминировано Pseudomonas aerugi-nosa.

Staphylococcus aureus

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела 2.6.12. 10 мл образца или количество, соответствующее 1 г или 1 мл продукта, помещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашку с агаризованной средой О и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-72 часов. Наличие черных колоний грампо-ложительных кокков, окруженных прозрачными зонами, свидетельствует о присут­ствии S. aureus. Подтверждение может быть получено путем проведения соответ­ствующих биохимических тестов, например, на коагулазу и дезоксирибонуклеазу. Продукт выдерживает испытание, если культура описанного типа на агаризован-ной среде О не обнаруживается или подтверждающие биохимические испытания дают отрицательный результат.

При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А пропускают через стерильный мембранный фильтр в соответствии с указаниями общего раз­дела 2.6.12, помещают мембранный фильтр в 100 мл жидкой среды А и инкуби­руют при температуре 35-37⁰С в течение 18-48 часов. После окончании периода инкубации пересевают на поверхность агаризованной среды О.

• Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной среды № 8, перемешивают и инкубируют при температуре 30-35°С в течение 24 - 48 часов. Делают пересев на чашку с плотной питательной средой №10 и инкубируют при температуре 30-35⁰С от 18 до 48 часов. Рост золотисто-желтых колоний, окружен­ных желтыми зонами (что свидетельствует о ферментации маннита), указывает на возможность загрязнения лекарственного средства S. aureus. В этом случае подозрительные колонии пересевают на скошенную плотную среду №1, инкуби­руют при температуре 30-35⁰С в течение 18-24 часов. Выросшие колонии микро-скопируют и, при выявлении грамотрицательных кокков, расположенных гроздья­ми, проводят тест на наличие фермента плазмокоагулаза.

• Тест на наличие плазмокоагулазы (реакция плазмокоагуляции) Кровь, взятую стерильным шприцем из сердца кролика, помещают в 5 % стерильный раствор натрия цитрата, отсасывают плазму, разводят 1:5 0,9% стерильным рас­твором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные про­бирки. В каждую пробирку помещают 1 петлю суточной культуры стафилококка и инкубируют при температуре от 30 до 35°С в течение 4 - 6 часов. Если в течение этого времени не наблюдают свертывание плазмы, реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной. Обязательно наличие двух контролей: 1) контроль рас­твора плазмы, 2) контроль культуры стафилококка, обладающего ферментом коа-гулазой.

• Допускается использовать сухую кроличью цитратную плазму промыш­ленного производства, которую разводят согласно наставлению по применению.

• Если в образце обнаружены грамположительные кокки, которые фермен­тируют маннит и дают положительную реакцию плазмокоагуляции, лекарственное средство контаминировано Staphylococcus aureus

Клостридии

Нижеописанные испытания проводят в различных целях. Первый метод предназначен для тех случаев, когда важным является исключение патогенных клостридий, и необходимо провести испытание на их отсутствие. Эти продукты обычно содержат небольшое общее количество микроорганизмов. Второй метод представляет собой полуколичественное определение Clostridium perfringens, и предназначен для продуктов, в которых количество этих микроорганизмов являет­ся критерием качества.

1. Испытание на клостридии. Готовят испытуемый продукт, как описано в разделе 2.6.12. Отбирают две равные порции, соответствующие 1 г или 1 мл про­дукта. Одну из порций нагревают при 80⁰С в течение 10 минут и быстро охлажда­ют. Другую порцию не нагревают. По 10 мл каждой из гомогенизированных порций переносят в две пробирки (38х200 мм) или в другие подходящие контейнеры, со­держащие 100 мл среды Р. Инкубируют в анаэробных условиях при 35-37⁰С в те­чение 48 часов. После инкубации делают пересев из каждой пробирки на среду Q с добавлением гентамицина и инкубируют в анаэробных условиях при 35-37⁰С в течение 48 часов. Если роста микроорганизмов не наблюдается, продукт выдер­живает испытание.

При наличии роста делают пересев каждой отдельной колонии на пита­тельную среду Q без гентамицина и инкубируют как в аэробных, так и в анаэроб­ных условиях. Наличие только анаэробного роста грамположительных палочек (с эндоспорами или без них), дающих отрицательную реакцию на каталазу, указыва­ет на присутствие Clostridium spp. При необходимости сравнивают морфологию колоний на двух чашках и проводят испытания на каталазу для исключения аэробных и факультативно анаэробных Bacillus spp, дающих положительную ре­акцию на каталазу. Это испытание может применяться к изолированным колониям на агаре или после их переноса на предметное стекло, путем добавления капли разбавленного раствора пероксида водорода R. Образование пузырьков газа яв­ляется признаком положительной реакции на каталазу.

2. Количество Clostridium perfringens. Используя продукт, подготовленный в соответствии с указаниями раздела 2.6.12, готовят разведения в соотношениях 1:100 и 1:1000 в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона рН 7,0. Определяют наиболее вероятное число бактерий, как описано в разделе 2.6.12, используя питательную среду R в пробирках или других подходящих контейнерах с помещенной внутрь маленькой трубкой Дюрама. Перемешивают при минималь­ном встряхивании и инкубируют при 45,5-46,5⁰С в течение 24-48 часов. Наличие в пробирках черного окрашивания, вызванного образованием сульфида железа, и сильного газообразования в трубках Дюрама (не менее 1/10 объема) указывает на присутствие Cl. perfringens. Наиболее вероятное количество C. рerfringens оцени­вают с использованием Таблицы 2.6.13.-2.

Контроль. Используют следующие тест-штаммы:

Для метода 1: Clostridium sporogenes, например, АТСС 19404 (NCTC 532) или CIP 79.3; # ГИСК 272

Для метода 2: Clostridium perfringens, например, АТСС 13124 (NCIMB 6125 и NCTC 8237, CIP 103 409).

При необходимости, комбинируют с Cl. sporogenes для проверки селектив­ности и анаэробных условий.

Ростовые свойства питательных сред и проверка пригодности методики ис­пытания

Описанные ниже испытания следует проводить, как минимум, для каждой партии сухой питательной среды.

В пробирках с подходящими средами (например, указанными ниже) выра­щивают по отдельности нижеприведенные тест-культуры при температуре 30-35⁰С в течение 18-24 часов.

Staphylococcus aureus например, АТСС 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83)

# или ATCC 6538 P

питательный бульон А, # жидкая среда №1

Pseudomonas aeruginosa например, ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118)

питательный бульон А, # жидкая среда

№1

Escherichia coli например, ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126),

# или АТСС 25922

питательный бульон А, # жидкая среда

№1

Salmonella typhimurium Рекомендации по конкретным штам-

мам отсутствуют. Может быть также использован штамм не патогенный для человека, например, Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80.39); питательный бульон А, # жидкая среда

№1

Порции каждой из культур разбавляют буферизированным раствором хло­рида натрия и пептона рН 7,0, получая тест-суспензии, содержащие около 1000 жизнеспособных микроорганизмов в миллилитре. Смешивают равные объемы ка­ждой суспензии и используют 0,4 мл полученной смеси (приблизительно 100 мик­роорганизмов каждого штамма) в качестве инокулята для проведения испытаний на E.coli, Salmonella, Ps. aeruginosa и S. aureus, при необходимости, в присутствии и в отсутствии испытуемого продукта. Для соответствующих микроорганизмов должен быть получен положительный результат.

• Тест-культуры можно выращивать на скошенной в пробирках плотной пи­тательной среде подходящего состава, например, среде №1. Для получения тест-суспензий выращенные в пробирках культуры смывают раствором натрия хлори­да 0,9% и разводят этим же раствором до нужного содержания клеток в милли­литре, используя стандарт мутности.

• Определение антимикробного действия нестерильных лекарствен­ных средств

Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств можно проводить с использованием следующих тест-микроорганизмов:

Bacillus cereus ATCC 10702 (NCTC 8035)

Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomonas aerugiosa ГИСК 453, АТСС 9027

Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р (FDA 209-Р)

Сandida albicans АТСС 885-653

Aspergillus niger BKM F-1119

Проведение испытания

Перед определением антимикробного действия культуры бактерий отсева­ют на скошенную в пробирках плотную питательную среду №1 и инкубируют при температуре от 30⁰С до 35⁰С в течение 18-24 часов.

Культуры грибов выращивают на скошенной плотной питательной среде №2 при температуре от 20⁰С до 25 ⁰С, С. аlbicans - 48 часов, А. niger - 7 суток.

Со скошенного агара культуры бактерий и С. аlbicans смывают раствором натрия хлорида 0,9%, культуру А. niger - этим же раствором с 0,05% полисорбата 80. Полученные суспензии разводят до концентрации 10³ КОЕ/мл для культур бак­терий и 10³ - 10⁴ КОЕ/мл для культур грибов.

Определение антимикробного действия для водорастворимых лекар-стенных средств

Готовят разведения лекарственного средства 1:10; 1:20; 1:50 (при необхо­димости ряд разведений может быть продолжен), используя фосфатный буфер­ный раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5 % по-лисорбата 80).

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0,2 мл взвеси культуры В. сereus, а в другие - по 0,2 мл культуры С. albicans и А. niger. В чашки с В. сereus вносят по 15-20 мл расплавленной среды № 1 при температуре (45 - 50) ⁰С, в чашки с культурами С. albicans и А. niger - то же количество среды № 2.

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - № 3 и № 8. В пробирки со средой № 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры Е.^Н, в пробирки со средой № 8 - по 1 мл взвеси культур Р.aeruginosa и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вме­сто разведения лекарственного средства вносят такое же количество буферного раствора.

Посевы на средах № 1, 3, 8, инкубируют при температуре от 30⁰С до 35 ⁰С в течение 2 суток (среды № 3, № 8) и 5 суток (среда № 1). Посевы на среде № 2 ин­кубируют при температуре от 20⁰С до 25⁰С в течение 5 суток. В случае, если при внесении лекарственного средства в жидкие питательные среды (№ 3, № 8) обра­зуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды № 3 на среду № 4 (агар Эндо), а со среды № 8 - на среды № 9 и № 10. При росте типичных колоний Е.^П (среда № 4), Р.aeruginosa (среда № 9) и S.aureus (среда № 10) отмечают наличие роста тест-микроорганизма.

Определение антимикробного действия для водонерастворимых лекар­ственных средств (метод репликаций).

В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемо­го лекарственного средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для получения разведения. В чашки Петри (как в экспери­менте, так и в контроле) добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до (45 - 50) ⁰С среды № 1, в другие - такое же количество среды № 2 и быстро пере­мешивают. После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденса­та с поверхности среды.

На поверхность агара бактериологической петлей или репликатором нано­сят бляшками инокулят каждого тест-штамма бактерий и грибов на среды № 1 и № 2 соответственно.

Чашки со средой № 1 инкубируют при температуре от 30⁰С до 35⁰С в течение 48 часов. Чашки со средой № 2 инкубируют при температуре от 20⁰С до 25⁰С в тече­ние 3-5 суток.

Учет результатов

После окончания сроков инкубации посевов (появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках без лекарственного средства) отме­чают наличие или отсутствие роста тест-штаммов бактерий и грибов на средах, в которые вносили различные разведения лекарственного средства.

Отсутствие роста тест-микроорганизма на среде с препаратом свидетель­ствует о том, что исследуемый препарат в данном разведении обладает антимик­робным действием в отношении определенного тест-микроорганизма.

НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АГЕНТЫ

Для нейтрализации активности антимикробных компонентов могут исполь­зоваться нейтрализующие агенты. Они могут быть добавлены к буферизирован-ному раствору хлорида натрия и пептона рН 7,0, предпочтительно, перед стери­лизацией. В случае применения нейтрализующих агентов должна быть показана их эффективность и нетоксичность в отношении микроорганизмов.

Типичная нейтрализующая жидкость имеет следующий состав:

Если нейтрализующая способность раствора недостаточна, концентрация полисорбата 80 или лецитина может быть увеличена. Кроме того, могут быть до­бавлены нейтрализаторы, перечисленные в Таблице 2.6.13.-3.

Таблица 2.6.13.-3

Инактиваторы антимикробных агентов, добавляемые к буферизированному рас­твору хлорида натрия и пептона рН 7,0

Тип антимик- | Инактиватор робного агента

Концентрация I Комментарий

Фенолы	Натрия лаурил-сульфат	4 г/л	Добавляют после стерили­зации буферизированного раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0
	Полисорбат 80 и лецитин	30 г/л и 3 г/л
	Яичный желток	5 мл/л - 50 мл/л
Ртутьоргани-ческие соеди­нения	Натрия тиоглико-лят	0,5 г/л - 5 г/л
Галогены	Натрия тиосуль­фат	5 г/л
Четвертичные аммониевые соединения	Яичный желток	5 мл/л - 50 мл/л	Добавляют после стерили­зации буферизированного раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ РАСТВОРЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Нижеописанные растворы и питательные среды удовлетворяют целям, для которых они предназначены в фармакопейном испытании на микробную контами­нацию. Могут быть использованы и другие среды, при условии, что они имеют аналогичные питательные и селективные свойства в отношении тестируемых микроорганизмов.

Буферизированный раствор хлорида натрия и пептона рН 7,0

Калия дигидрофосфат 3,6 г

Натрия гидрофосфата дигидрат, эквивалент фосфата 0,067 М 7,2 г

Натрия хлорид 4,3 г

Пептон (мясной или казеиновый) 1,0 г

Вода очищенная 1000 мл

К этому раствору могут быть добавлены поверхностно-активные компонен­ты и инактиваторы антибактериальных агентов, например, полисорбат 80 в коли­честве от 1 г/л до 10 г/л. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в тече­ние 15 минут.

Питательный бульон А (бульон на основе гидролизатов казеина и соевых бобов)

Панкреатический гидролизат казеина 17,0 г

Папаиновый гидролизат соевых бобов 3,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Калия гидрофосфат 2,5 г

Глюкозы моногидрат 2,5 г

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 7,3±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут.

Агаризованная среда В (агаризованная среда на основе гидролизатов ка­зеина и соевых бобов)

Панкреатический гидролизат казеина 15,0 г

Папаиновый гидролизат соевых бобов 5,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Агар 15,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 7,3±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут.

Агаризованная среда С (декстрозный агар Сабуро с антибиотиками)

Пептоны (мясной и казеиновый) 10,0 г

Глюкозы моногидрат 40,0 г

Агар 15,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 5,6±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут. Непосредственно перед применением на литр среды добавляют 0,10 г бензилпенициллина натриевой соли и 0.10 г тетрациклина в виде стерильных рас­творов или добавляют 50 мг хлорамфеникола на 1 литр среды перед стерилиза­цией.

Питательный бульон D (лактозный бульон)

Говяжий экстракт 3,0 г

Панкреатический гидролизат желатина 5,0 г

Лактозы моногидрат 5,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 6,9±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут и немедленно охлаждают.

Обогатительный питательный бульон Е (обогатительный бульон Моссе-ля для энтеробактерий)

Панкреатический гидролизат желатина 10,0 г

Глюкозы моногидрат 5,0 г

Дегидратированная бычья желчь 20,0 г

Калия дигидрофосфат 3,0 г

Натрия гидрофосфата дигидрат 8,0 г

Бриллиантовый зеленый 15 мг

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после нагрева оно составляло 7,2±0,2. Нагревают при 100⁰С в течение 30 минут и немедленно охлаждают.

Агаризованная среда F (агаризованная среда с глюкозой, кристалличе­ским фиолетовым, нейтральным красным и желчью)

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Панкреатический гидролизат желатина 7,0 г

Соли желчных кислот 1,5 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Глюкозы моногидрат 10,0 г

Агар 15,0 г

Нейтральный красный 30 мг

Кристаллический фиолетовый 2 мг

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после нагрева оно составляло 7,4±0,2. Нагревают до кипения: не нагревают в автоклаве.

Питательный бульон G (бульон Макконки)

Панкреатический гидролизат желатина 20,0 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Дегидратированная бычья желчь 5,0 г

Бромкрезоловый пурпурный 10 мг

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 7,3±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут.

Агаризованная среда H (агар Макконки)

Панкреатический гидролизат желатина 17,0 г

Пептоны (мясной и казеиновый) 3,0 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Соли желчных кислот 1,5 г

Агар 13,5 г

Нейтральный красный 30,0 мг

Кристаллический фиолетовый 1 мг

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 7,1±0,2. Кипятят в течение одной минуты при постоянном встряхивании, затем стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут.

Питательный бульон I (бульон на основе тетратионата, желчи и брилли­антового зеленого)

Пептон 8,6 г

Бычья желчь, высушенная 8,0 г

Натрия хлорид 6,4 г

Кальция карбонат 20,0 г

Калия тетратионат 20,0 г

Бриллиантовый зеленый 70 мг

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после нагрева оно составляло 7,0±0,2. Нагревают только до кипения. Повторное нагревание не допускается

Агаризованная среда J (агар на основе дезоксихолата и цитрата)

Говяжий экстракт 10,0 г

Мясной пептон 10,0 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Натрия цитрат 20,0 г

Железа (III) цитрат 1,0 г

Натрия дезоксихолат 5,0 г

Агар

Нейтральный красный Вода очищенная

13,5 г

20 мг 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после нагрева оно составляло 7,3±0,2. Осторожно нагревают до кипения и кипятят 1 минуту, охлаждают до 50⁰С и разливают по чашкам Петри. Не автоклавируют.

Агаризованная среда К (агар на основе ксилозы, лизина, дезоксихолата)

Ксилоза L-Лизин

Лактозы моногидрат Сахароза Натрия хлорид Дрожжевой экстракт Феноловый красный Агар

Натрия дезоксихолат Натрия тиосульфат Железа(Ш)-аммония цитрат Вода очищенная

3,5 г 5,0 г

7,5 г 7,5 г

5,0 г 3,0 г 80 мг 13,5 г

2,5 г

6,8 г 0,8 г

1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после нагрева оно составляло 7,4±0,2. Нагревают только до кипения, охлаждают до 50⁰С и разливают по чашкам Петри. Не автоклавируют.

Агаризованная среда L (агар на основе бриллиантового зеленого, фено­лового красного, лактозы и сахарозы)

Пептоны (мясной или казеиновый) 10,0 г

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Сахароза 10,0 г

Агар 20,0 г

Феноловый красный 80 мг

Бриллиантовый зеленый 12,5 мг

Вода очищенная 1000 мл

Нагревают до кипения и кипятят 1 минуту. Значение рН доводят таким об­разом, чтобы после стерилизации оно составляло 6,9±0,2. Непосредственно пе­ред использованием стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут, охлаждают до 50⁰С и разливают по чашкам Петри.

Агаризованная среда М (тройной агар на основе сахара и железа)

Говяжий экстракт 3,0 г

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Пептоны (казеиновый или говяжий) 20,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Сахароза 10,0 г

Глюкозы моногидрат 1,0 г

Железа(Ш)-аммония цитрат 0,3 г

Натрия тиосульфат 0,3 г

Феноловый красный 25 мг

Агар

Вода очищенная

12,0 г

1000 мл

Нагревают до кипения и кипятят 1 минуту, встряхивая. Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,4±0,2. Разливают по пробиркам на третью часть их высоты, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут и оставляют до охлаждения в положении, обеспечи­вающем получение образца в форме столбика и скошенной поверхности.

Агаризованная среда N (агар на основе цетримида)

Панкреатический гидролизат желатина 20,0 г

Магния хлорид 1,4 г

Калия сульфат 10,0 г

Цетримид 0,3 г

Агар 13,6 г

Вода очищенная 1000 мл

Глицерин 10,0 мл

Нагревают до кипения и кипятят 1 минуту, встряхивая. Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,2±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут.

Агаризованная среда О (агар Байерд-Паркера)

Панкреатический гидролизат казеина 10,0 г

Говяжий экстракт 5,0 г

Дрожжевой экстракт 1,0 г

Лития хлорид 5,0 г

Агар 20,0 г

Глицин 12,0 г

Натрия пируват 10,0 г

Вода очищенная 950 мл

Нагревают до кипения и кипятят 1 минуту, встряхивая. Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 6,8±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут, охлаждают до 45-50⁰С и добавляют 10 мл стерильного раствора теллурита калия с концентрацией 10 г/л и 50 мл эмульсии яичного желтка.

Питательная среда Р (обогащенная среда для клостридий)

Говяжий экстракт 10,0 г

Пептон 10,0 г

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Растворимый крахмал 1,0 г

Глюкозы моногидрат 5,0 г

Цистеина гидрохлорид 0,5 г

Натрия хлорид 5,0 г

Натрия ацетат 3,0 г

Агар 0,5 г

Вода очищенная 1000 мл

Агар замачивают, растворяют путем нагревания до кипения при постоянном перемешивании. При необходимости, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло около 6,8. Стерилизуют в паровом стерили­заторе при 121⁰С в течение 15 минут.

Питательная среда Q (колумбийский агар)

Панкреатический гидролизат казеина Пепсиновый гидролизат мяса Панкреатический гидролизат сердца Дрожжевой экстракт Маисовый крахмал Натрия хлорид

Агар, в зависимости от гелеобразующей способности Вода очищенная

5,0 3,0 5,0 1,0 5,0

10,0 - 15,0 г 1000 мл

Агар замачивают, растворяют путем нагревания до кипения при постоянном перемешивании. При необходимости, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,3±0,2. Стерилизуют в паровом стерилиза­торе при 121⁰С в течение 15 минут. Охлаждают до 45-50⁰С, добавляют, при необ­ходимости, гентамицина сульфат в количестве, соответствующем 20 мг основания гентамицина, и разливают по чашкам Петри.

Питательная среда R (среда на основе лактозы и сульфита)

Панкреатический гидролизат казеина 5,0 г

Дрожжевой экстракт 2,5 г

Натрия хлорид 2,5 г

Лактозы моногидрат 10,0 г

Цистеина гидрохлорид 0,3 г

Вода очищенная 1000 мл

Растворяют, доводят до рН 7,1 ±0,1 и разливают по 8 мл в пробирки разме­ром 16 мм х 160 мм, содержащие маленькие трубки Дюрама. Стерилизуют в паро­вом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15 минут и хранят при 4⁰С.

Перед использованием питательную среду нагревают в течение 5 минут на водяной бане и охлаждают. В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл раствора на­трия метабисульфита R концентрацией 12 г/л и 0,5 мл раствора железа(Ш)-аммония цитрата концентрацией 10 г/л. Оба раствора должны быть свежеприго­товленными и профильтрованы через мембраны (размер пор 0,45 мкм).

Агаризованная среда S (R2A)

Дрожжевой экстракт 0,5 г

Протеозопептон 0,5 г

Гидролизат казеина 0,5 г

Глюкоза 0,5 г

Крахмал 0,5 г

Калия гидрофосфат 0,3 г

Магния сульфат, безводный 0,024 г

Натрия пируват 0,3 г

Агар 15,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 7,2±0,2. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121⁰С в течение 15

минут.

# Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном (1/15

моль)

Калия фосфат однозамещенный Натрия фосфат двузамещенный

3,56 г 7,23 г

Натрия хлорид 4,3 г

Пептон ферментативный сухой 1,0 г

Вода очищенная до 1000 мл

рН 7,0

Компоненты растворяют в очищенной воде при нагревании, фильтруют че­рез бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15

минут.

Среда № 1 - для выращивания бактерий

Пептон ферментативный сухой 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Глюкоза 1,0 г

Агар 13,0 г

Мясная вода 1000 мл

Все компоненты растворяют в мясной воде при нагревании, вносят глюкозу, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,3 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, прибавляют агар, нагревают до полного его расплав­ления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 ⁰С в течение 15 минут.

Жидкая среда №1 (мясо-пептонный бульон)

Пептон ферментативный сухой 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Глюкоза 1,0 г

Мясная вода 1000 мл

К мясной воде добавляют пептон и натрия хлорид, растворяют при нагре­вании, вносят глюкозу, значение рН доводят таким образом, чтобы после стери­лизации оно составляло 7,3 ± 0,2. Кипятят 1 мин. Фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 ⁰С в течение 15 минут.

Среда № 2 - для выращивания грибов (Сабуро-агар)

Пептон ферментативный сухой 10,0 г

Глюкоза 40,0 г

Агар 13,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Все компоненты растворяют в воде при нагревании, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 5,6 ± 0,2. Прибавляют агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Для подавления роста бактерий после стерилизации прибавляют 100 мг бензилпенициллина и 100 мг тетрациклина (либо перед стерилизацией - 50 мг левомицетина) на 100 мл среды.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 ⁰С в течение 15 минут.

Среда № 3 - для обогащении для бактерий семейства_ Enterobacteriaceae

Пептон ферментативный сухой

10,0 г

Калия фосфат однозамещенный 2,5 г

Натрия фосфат двузамещенный 7,5 г

Глюкоза 10,0 г

Феноловый красный 0,08 г

Малахитовый зеленый 0,015 г

Мясная вода 1000 мл

Пептон и соли растворяют в мясной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 мл 1 % раствора фенолового красного и 3 мл 0,5 % раствора мала­хитового зеленого, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилиза­ции оно составляло 7,3 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15

минут.

Среда № 4 (агар Эндо) - для выделения бактерий семейства Enterobacteri-

aceae.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0 г

Экстракт пекарных дрожжей 1,0 г

Натрий хлористый 3,4 г

Натрия сульфит безводный 0,8 г

Натрия фосфат двузамещенный 0,5 г

D - лактоза 10,0 г

Фуксин основной 0,2 г

Агар 15,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Ингредиенты размешивают в воде, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,4 ± 0,2. Нагревают до полного рас­плавления агара и кипятят 2-3 мин. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, снова нагревают до момента закипания. Охлаждают до температуры от 45⁰С до 50⁰С и разливают в чашки Петри.

Среда № 5 (висмутсульфит агар) - для выделения бактерий семейства En-terobacteriaceae

Панкреатический гидролизат мяса 10,1 г

Натрия фосфат двузамещенный 3,68 г

Натрия хлорид 2,6 г

Натрия карбонат 0,65 г

Висмута цитрат 2,38 г

Железа(1|) аммония сульфат 0,97 г

D-глюкоза 3,9 г

Агар 15,0

Бриллиантовый зеленый 0,028

Вода очищенная 1000 мл

Ингредиенты размешивают в воде, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,6 ± 0,2. Нагревают до полного рас­плавления агара и кипятят 3-5 минут. Охлаждают до температуры от 45⁰С до 50⁰С и разливают в чашки Петри.

10,0 г

5,0 г

Среда № 6 - для определения ферментации глюкозы:

Пептон ферментативный сухой Натрия хлорид

Глюкоза 40,0 г

Феноловый красный 0,08 г

Мясная вода 1000 мл

Пептон и натрия хлорид растворяют в мясной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 мл 1 % раствора фенолового красного, значение рН дово­дят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,2 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, фильтруют через бумажный фильтр и разливают в пробирки с поплавками по 4 - 5 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121°С в тече­ние 15 минут. По окончании стерилизации быстро охлаждают.

Среда № 7 - для определения восстановления нитратов в нитриты:

Пептон ферментативный сухой 5,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Калия нитрат 1,5 г

Вода очищенная 1000 мл

Все компоненты растворяют в воде при нагревании, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,2 ± 0,2. Кипятят 1 ми­нуту, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 4 - 5 мл. Сте­рилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121°С в течение 15 минут.

Среда № 8 - среда обогащения для Pseudomonas aeruginosa и Staphylococ­cus aureus

Пептон ферментативный сухой 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Калия фосфат двузамещенный 2,5 г

Глюкоза 2,5 г

Вода очищенная до 1000 мл

Пептон и соли растворяют в воде при нагревании, вносят глюкозу, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,3 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121°С в течение 15

минут.

Среда № 9 - для выявления пигмента пиоцианина

Пептон ферментативный сухой 20,0 г

Магния хлорид безводный 1,4 г

Калия сульфат безводный 10,0 г

Глицерин 10,0 мл

Агар 15,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Пептон и соли растворяют в воде. Затем вносят глицерин, растворяют при нагревании, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,2 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, прибавляют агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121°С в течение 15

минут.

Среда № 10 - для идентификации Staphylococcus aureus

Пептон ферментативный сухой 10,0 г

Натрия хлорид 75,0 г

Маннит 10,0 г

Феноловый красный 0,025 г

Агар 15,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют 2,5 мл 1 % раствора фе­нолового красного, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилиза­ции оно составляло 7,4 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, прибавляют агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15

минут.

Среда № 11 - для предварительного обогащения энтеробактерий

Пептон ферментативный сухой 8,0 г

Лактоза 5,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Все компоненты растворяют в воде при нагревании, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 6,9 ± 0,1. Фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15

минут.

Среда № 12 (селенитовая среда) - для накопления и выделения бактерий рода Salmonellа

Панкреатический гидролизат казеина 5,26 г

Лактоза 4,21 г

Динатрия фосфат 6,32

Натрий селенистокислый кислый (без теллура) 4,21 г

Вода очищенная 1000 мл

Препарат гигроскопичен и светочувствителен.

Указанное в прописи количество тщательно размешивают в 1000 мл воды. Колбу закрывают ватной пробкой, быстро доводят до кипения (до образования пу­зырьков) и сразу прекращают нагрев. рН после стерилизации - 7,5 ± 0,2.

Среда № 13 (трехсахарный агар с солями железа)

Мясной экстракт 3,0 г

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Пептон 20,0 г

Лактоза 10,0 г

Сахароза 10,0 г

Глюкоза 1,0 г

Железа сульфат 0,2 г

Натрия хлорид 5,0 г

Натрия тиосульфат (серноватистокислый)

Феноловый красный

Агар

Вода очищенная

0,3 г 0,024 г

15,0 г

1000 мл

Ингредиенты растворяют в воде при нагревании, значение рН доводят та­ким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,3 ± 0,2. Фильтруют че­рез ватно-марлевый фильтр.

Среду разливают в пробирки по 7 мл.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15 минут.

При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2,5 - 3,0 см. Среда № 14 (цитратный агар Симмонса)

Натрия хлорид 5,0 г

Магния сульфат 0,2 г

Аммония дигидрофосфат 1,0 г

Калия гидрофосфат 1,0 г

Натрия цитрат 3,0 мл

Бромтимоловый синий 0,08 г

Агар 20,0 г

Вода очищенная 1000 мл

Соли растворяют в воде, вносят агар и нагревают до полного его расплав­ления, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со­ставляло 7,2 ± 0,1. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют 40 мл 0,2 % водного раствора бромтимолового синего.

Среду разливают в пробирку по 5-7 мл.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15

минут.

При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2,0 - 2,5 см.

Среда № 15 (бульон Хоттингера) - для определения индола

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием амин- 1000 мл ного азота 120-140 мг %

Натрия хлорид

Калия фосфат двузамещенный

или калия фосфат двузамещенный 3-водный

5,0 г 1,0 г 1,31 г

Гидролизат Хоттингера разводят водой до содержания в среде 120-140 мг% аминного азота, добавляют соли, значение рН доводят таким образом, чтобы по­сле стерилизации оно составляло 7,5 ± 0,1. Кипятят 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121⁰С в течение 15

минут.