2.6.15. Активатор прекалликреина

Активатор прекалликреина (АПК) активирует прекалликреин, переводя его в калликреин, и может быть определен по его способности к отщеплению хромофо­ра от синтетического пептидного субстрата в условиях, позволяющих определять скорость распада спектрофотометрическим методом; концентрация АПК вычис­ляется путем сравнения со стандартным препаратом, калиброванным в Междуна­родных Единицах.

За Международную Единицу принята активность установленного количест­ва Международного Стандарта, представляющего собой лиофильно высушенный активатор прекалликреина. Эквивалентность Международного Стандарта в Меж­дународных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохране­ния.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУБСТРАТА ПРЕКАЛЛИКРЕИНА

Для предотвращения активации коагуляции кровь или плазма, используе­мая для приготовления прекалликреина, должна контактировать только с пла­стиком или стеклянными поверхностями, обработанными силиконом.

9 объемов человеческой крови приливают к 1 объему антикоагулянтного раствора (ACD, CPD или раствора цитрата натрия R концентрацией 38 г/л), к которому добавлен гексадиметрина бромид R в количестве 1 мг/мл. Смесь цен­трифугируют при 3600 g в течение 5 минут. Отделяют плазму и снова центрифу­гируют при 6000 g в течение 20 минут для осаждения тромбоцитов. Плазму с уменьшенным содержанием тромбоцитов отделяют и подвергают диализу против 10 объемов буфера А в течение 20 часов. Диализированную плазму наносят на хроматографическую колонку, содержащую агарозу-DEAE для ионообменной хроматографии R, уравновешенную с помощью буфера А, в количестве, равном двойному объему плазмы. Колонку элюируют буфером А со скоростью 20 мл/см²/ч. Собирают фракции элюата, регистрируя оптическую плотность при 280 нм (2.2.25). Фракции, содержащие первый пик белка, объединяют таким образом, чтобы объем объединенных фракций составлял 120% объема плазмы с понижен­ным содержанием тромбоцитов.

Проверяют отсутствие калликреиновой активности в объединенном раство­ре субстрата, смешивая его в соотношении 1:20 с предварительно подогретым раствором хромогенного субстрата, который будет использоваться в определе­нии, и инкубируют при 37⁰С в течение 2 минут. Субстрат может быть использован в испытании, если увеличение оптической плотности составляет менее 0,001 еди­ницы в минуту. К собранному раствору добавляют натрия хлорид R в количестве 7 г/л и фильтруют через мембранный фильтр (пористость 0,45 мкм). Порции суб­страта замораживают и хранят при температуре -25⁰С; субстрат перед хранением может быть подвергнут высушиванию из замороженного состояния.

Все процедуры от начала хроматографии до заморозки порций субстрата выполняют в течение одного рабочего дня.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Определение предпочтительно выполнять с использованием автоматиче­ского анализатора ферментов при температуре 37⁰С, используя такие объемы, концентрации субстратов и времена инкубации, чтобы скорость реакции находи­лась в линейной зависимости, по крайней мере, до концентрации 35 МЕ/мл. Стан­дарты, образцы и субстрат прекалликреина могут быть при необходимости раз­бавлены буфером В.

Разбавленные стандарты или образцы инкубируют с субстратом прекал-ликреина в течение 10 минут так, чтобы объем неразбавленного образца не пре­вышал 1/10 общего объема инкубируемой смеси, во избежание ошибок, связан­ных с изменением ионной силы и показателя рН инкубируемой смеси. Смесь или ее часть инкубируют не менее, чем с равным объемом раствора подходящего синтетического хромогенного субстрата с установленной специфичностью к кал-ликреину (например, М-бензоил-1--пролил-1--фенилаланил-1--аргинина 4-нитроанилида ацетата R или D-пролил-Ь-фенилаланил-Ь-аргинина 4-нитроанилида дигидрохлорида R), растворенного в буфере В. Регистрируют ско­рость изменения оптической плотности в минуту в течение промежутка времени от 2 до 10 минут при длине волны, специфичной для используемого субстрата. Для каждой смеси образца или стандарта готовят контроль, в котором вместо субстрата прекалликреина содержится буфер В.

Вносят поправки в значение АА/мин, вычитая результат, полученный для соответствующего контроля. Строят калибровочную кривую, используя значения, полученные таким образом для препарата сравнения в соответствующих концен­трациях; используют полученную кривую для определения активности АПК в ис­пытуемом препарате.

Буфер А

Трис-(гидроксиметил)-аминометан R 6,055 г

Натрия хлорид R 1,17 г

Гексадиметрина бромид R 50 мг

Натрия азид R 0,100 г

Растворяют ингредиенты в воде R, доводят значение рН до 8,0 с помощью 2М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл водой R.

Буфер В

Трис-(гидроксиметил)-аминометан R 6,055 г

Натрия хлорид R 8,77 г

Растворяют ингредиенты в воде R, доводят значение рН до 8,0 с помощью 2М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл водой R.