3.3. Процедура исследования

3.3.1. Определение уровня доза-ответ

Приготовление растворов

Стандарт интерферона (например специфический подтип стандарта ВОЗ интерферона) разводят в культуральной среде А, в 10-ти кратных разведениях таким образом, чтобы доза была в диапазоне 1000 - 0,001 МЕ/мл. Процедура исследования выполняется в 96 ячеечном микротитровом планшете. В каждую ячейку добавляют 100 мкл культуральной среды А. Затем в каждую ячейку, за исключением тех, которые предназначены для вирусных контролей, добавляют приблизительно 100 мкл каждого раствора препарата сравнения, используя многоканальные пипетки на 100 мкл. Содержимое ячеек перемешивают.

Распределение клеточной суспензии

Суспензию клеток Hep2c, содержащую приблизительно 610⁵ клеток/мл клеточной культуры А, разливают в пластиковые чашки Петри.

Используя многоканальную пипетку на 100 мкл, переносят клеточную суспензию из чашек Петри в каждую ячейку многотитровых планшетов. Помещают планшеты приблизительно на 24 ч в инкубатор, установленный на 37°С и содержащий 5% углерода диоксида.

Вирусная инфекция

На этом этапе, используя микроскоп, проверяют, чтобы монослои клеток Hep2c были сплошными, имели правильную морфологию и были живыми.

Удаляют большую часть культуральной среды, перевернув планшет, встряхнув его и промокнув бумажным полотенцем (процедура идентична той, что описывается ниже по удалению жидкости из микротитровых планшетов). Разводят ЭМКВ свежей культуральной средой А до титра приблизительно 310⁷ БОЕ/мл (Примечание: в каждом планшете должно быть около 20 мл вирусной суспензии плюс от 5 до 10% сверх объема).

Разведенную суспензию, полученную из 9 см стерильных чашек Петри, распределяют, используя многоканальные пипетки, установленные на 200 мкл, во все ячейки, включая вирусные контроли, за исключением клеточных контролей. Добавляют приблизительно 200 мкл культуральной среды А без вируса в каждую ячейку с клеточным контролем.

Планшет помещают в термостат, установленный на 37°С и содержащий 5% углерода диоксида на 24 ч.

Окрашивание

Планшеты проверяют через микроскоп на предмет того, что ЭМКВ вызвал цитопатический эффект (ц.п.э.) в вирусных контролях. Временной интервал для максимального ц.п.э. может варьировать от одного исследования к другому вследствие характерных изменений клеток Hep2c на введение вируса в течение данного периода непрерывного культивирования.

Большую часть культуральной среды удаляют из ячеек в соответствующий дезинфицирующий раствор (например, натрия гипохлорит). В каждую ячейку добавляют солевой фосфатный буфер рН 7,4 Р. Сливают солевой фосфатный буфер рН 7,4 Р в дезинфицирующий раствор. В каждую ячейку добавляют 150 мкл окрашивающего раствора. Клетки окрашивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Сливают окрашивающий раствор в дезинфицирующий раствор. Распределяют приблизительно 150 мкл фиксирующего раствора. Фиксируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Сливают фиксирующий раствор в дезинфицирующий раствор и промывают клеточный монослой, погрузив планшеты в пластиковые контейнеры с проточной водой. Удаляют воду и промокают планшеты бумажными полотенцами. Высушивают планшеты при температуре от 20 С до 37°С до тех пор, пока не испарится вся влага.

В каждую ячейку добавляют 150 мкл 0,1 M раствора натрия гидроксида Р. Элюируют краску аккуратным встряхиванием планшетов или постукиванием ладонью руки. Перед тем, как снимать спектрометрические показания, необходимо убедиться, что краска равномерно распределилась по всем ячейкам. Снимают показания при длине волны от 610 нм до 620 нм, используя считыватель микротитрового планшета, а в качестве слепой пробы - ячейку или ряд ячеек, содержащих около 150 мкл 0,1 M натрия гидроксида Р и не содержащих клеток. Определяют концентрации интерферон-стандарта, которые вызывают максимальное и минимальное снижение цитопатического эффекта. Это и есть дозовая зависимость, соответствующая рабочему интервалу исследования.

2. Процедура исследования

Исследование проводят в соответствии с тем, как описано выше, используя в качестве растворов:

- вещество для исследования, разбавленное двумя объемами культуральной среды А для достижения номинальных концентраций, охватывающих рабочий диапазон исследования;

- в качестве растворов сравнения используют соответствующий стандарт интерферона (например, специфический подтип интерферона ВОЗ), разведенный в двух объемах культуральной среды А для достижения номинальных концентраций, охватывающих рабочий диапазон исследования.

3. Анализ данных

Результаты исследования снижения цитопатического эффекта в основном соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ, когда функция представлена графически - концентрация интерферона (логарифм обратной величины разведения интерферона) к поглощению красителя.

Строят график функции концентрации интерферона (логарифм обратной величины разведения) к поглощению красителя для стандартного препарата интерферона и для экспериментальных растворов интерферона. Используя линейный участок графика, рассчитывают концентрацию интерферона в образце путем сравнения реакций для экспериментального и стандартного растворов, используя обычные статистические методы для параллельного анализа.

4. ВАЛИДАЦИЯ ДРУГИХ ПРОЦЕДУР

1. ВЫБОР КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И ВИРУСА

В антивирусных исследованиях интерферона использовался целый ряд других комбинаций клеточных культур и вирусов. Например, ЕМСУ использовался в комбинации с эпителиальной клеточной культурой A549 карциномы легких, вирус Semliki Forest или вирус Sindbis использовались с фибробластами человека, с клеточной культурой амниона человека, вирус WISH или Madin-Darby с почечной клеточной культурой крупного рогатого скота. В каждом случае выбор комбинации клеточная культура/вирус основывается на том, какая из них дает наиболее чувствительный ответ на препарат интерферона, предназначенный для исследования, и дает параллельные реакции при сравнении экспериментального препарата и интерферонового стандарта.

2. ВЫБОР РЕАКЦИИ

Процедура окрашивания, описанная выше, оценивает оставшиеся жизнеспособные клетки. Кроме того, применялся целый ряд других реакций, включая окрашивание метиленовым синим или кристаллическим фиолетовым или преобразование тиазолинового синего (МТТ). В каждом случае выбор метода основывался на получении подходящей линейной и чувствительной зависимости между реакцией цвета и количеством жизнеспособных клеток.

3. СТАТИСТИЧЕСКОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ

Как и в случае с параллельными биоанализами, данное исследование должно соответствовать обычным статистическим критериям линейности реакции, параллелизма и дисперсии.

4. ВАЛИДАЦИЯ ПЛАНИРОВАНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как и в случае с процедурой микротитрового планшета, необходимо уделять внимание планированию исследования. В частности, необходимо предусмотреть и исключить системные ошибки в результате неслучайного порядка пипетирования и других факторов.

РЕАГЕНТЫ И КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА

• 450мл

- 5мл

• 490мл

Культуральная среда a (10% неонатальная телячья сыворотка) RPMI 1640 культурная среда, дополненная при необходимости антибиотиками (пенициллин 10000 МЕ/мл; стрептомицин 10 нг/мл) L-глютамин, 200 мМ, стерильный

- 5мл

• 10мл

• 0,5 г

• 90 мл - 8,2 г

-1000 мл

Культуральная среда b (2% эмбриональной коровьей сыворотки) RPMI 1640 культуральная среда, дополненная при необходимости антибиотиками (пенициллин 10000 МЕ/мл; стрептомицин 10нг/мл) L-глютамин, 200 мМ, стерильный Эмбриональная коровья сыворотка Окрашивающий раствор Нафталин черный Кислота уксусная ледяная Натрия ацетат безводный Вода

Фиксирующий раствор

Формальдегид 40 % -100 мл

Кислота уксусная ледяная - 90 мл

Натрия ацетат безводный - 8,2 г

Вода - 1000 мл