2.6. Биологические испытания

2.6.1. Стерильность

Испытание применяется для субстанций, лекарственных средств или изделий, которые, в соответствии с Фармакопеей, должны быть стерильны. Однако, удовлетворительный результат показывает лишь то, что в условиях испытания в тестируемом образце не обнаружено микроорганизмов. Руково­дство по использованию испытания на стерильность приводится в конце раз­дела.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРОТИВ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ

Испытание на стерильность выполняют в асептических условиях. Для дос­тижения таких условий обстановка, в которой выполняется испытание, должна быть адаптирована к способу его проведения. Меры предосторожности, прини­маемые против контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, обнаруживаемых в ходе испытания. Рабочие условия, в которых выполняется ис­пытание, регулярно контролируются путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны, а также проведением соответствующих контрольных испытаний.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРЫ ИНКУБАЦИИ

Среды для проведения испытаний могут быть приготовлены в соответ­ствии с приведенными ниже указаниями; также могут использоваться эквива­лентные коммерчески доступные среды, при условии, что они выдерживают испытания на питательные свойства.

Показано, что следующие питательные среды являются подходящими для испытания на стерильность. Жидкая тиогликолевая среда предназначена в пер­вую очередь для культивирования анаэробных бактерий, но также обнаруживает и аэробные бактерии. Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина # и среда Сабуро подходит для культивирования как грибов, так и аэробных бактерий.

Могут быть использованы также и другие среды, при условии их соответст­вия требованиям испытаний на пригодность.

рН среды после стерилизации 7,1 ±0,2

Смешивают L-цистин, агар, натрия хлорид, глюкозу, водорастворимый дрожжевой экстракт и панкреатический гидролизат казеина с 1000 мл воды и на­гревают до получения раствора. Натрия тиогликолят или тиогликолевую кислоту растворяют в полученной смеси и, при необходимости, добавляют 1 М раствор гидроксида натрия так, чтобы после стерилизации значение рН раствора состав­ляло 7,1 ±0,2. Если необходима фильтрация, раствор снова нагревают, не доводя до кипения, и фильтруют в горячем виде через увлажненную фильтровальную бумагу. Добавляют раствор резазурина натриевой соли, перемешивают и поме­щают среду в подходящие сосуды, которые обеспечивают такое отношение по­верхности к глубине среды, чтобы изменению окраски, указывающему на погло­щение кислорода в конце периода инкубирования, был подвержен только верхний слой, составляющий не более трети от общего объема среды. Стерилизуют с ис­пользованием процесса с подтвержденной эффективностью. Среду хранят при температуре 2-25⁰С в стерильном герметичном контейнере. Если верхний слой, составляющий не более трети от общего объема среды, приобретает розовую ок­раску, среду можно однократно регенерировать путем нагрева контейнеров на во­дяной бане или в струе пара до исчезновения розовой окраски с последующим быстрым охлаждением; при этом должны быть приняты меры предосторожности против попадания в контейнер нестерильного воздуха. Среду не используют по истечении валидированных сроков хранения.

Жидкую тиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35⁰С.

Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина

Панкреатический гидролизат казеина 17,0 г

Папаиновый гидролизат сои 3,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Калия гидрофосфат 2,5 г

Глюкозы моногидрат / Безводная глюкоза 2,5 г / 2,3 г

Вода 1000 мл

рН среды после стерилизации 7,3±0,2

Твердые компоненты растворяют в воде, слегка нагревая для получения раствора. Раствор охлаждают до комнатной температуры. При необходимости добавляют 1 М раствор гидроксида натрия так, чтобы после стерилизации значе­ние рН раствора составляло 7,3±0,2. При необходимости устранения мутности раствор фильтруют, разливают по подходящим сосудам и стерилизуют с исполь­зованием процесса с подтвержденной эффективностью. Если среда не подлежит немедленному использованию, ее хранят при температуре 2-25⁰С в стерильном герметичном контейнере. Среду не используют по истечении валидированных сроков хранения.

Среду на основе гидролизатов соевых бобов и казеина инкубируют при температуре 20-25⁰С.

# Допускается использование среды Сабуро.

Пептон ферментативный 10,0 г

Глюкоза 40,0 г

Вода до 1000 мл

рН после стерилизации 5,6 ± 0,2

Среду Сабуро инкубируют при температуре 20-25⁰С.

Используемая среда должна выдерживать следующие испытания, прово­димые для каждой партии до или одновременно с испытанием тестируемой про­дукции.

Стерильность. Порции среды инкубируют в течение 14 дней. Роста микро­организмов наблюдаться не должно.

Питательные свойства в отношении аэробов, анаэробов и грибов.

Проверке подвергают каждую партию готовой среды, и каждую партию среды, приготовленной из обезвоженных составов или из ингредиентов. Подходящие штаммы микроорганизмов приведены в Таблице 2.6.1.-1.

Порции жидкой тиогликолевой среды засевают небольшим количеством (не более 100 колониеобразующих единиц) следующих микроорганизмов: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Для каждого из штаммов используют отдельную порцию среды. Порции среды на основе гидро-лизатов соевых бобов и казеина (# или среды Сабуро) засевают небольшим коли­чеством (не более 100 колониеобразующих единиц) следующих микроорганизмов: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Candida albicans. Для каждого из штаммов ис­пользуют отдельную порцию среды. Инкубируют в течение не более 3 дней в слу­чае бактерий и не более 5 дней в случае грибов.

При получении рабочей культуры, используемой при проведении испыта­ния, число пересевов, произведенных от исходного штамма, не должно превы­шать пяти.

Среды являются пригодными при условии наличия четкого визуально на­блюдаемого роста микроорганизмов.

ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ МЕТОДИКИ ИСПЫТАНИЯ

Проверку методики испытания выполняют в соответствии с нижеприведен­ным описанием теста на стерильность испытуемого продукта с использованием в точности аналогичного метода со следующими модификациями.

Мембранная фильтрация. После переноса содержимого испытуемого кон­тейнера или контейнеров на мембрану заключительную порцию стерильного рас­творителя, используемого для промывки фильтра, инокулируют небольшим коли­чеством жизнеспособных микроорганизмов (не более 100 колониеобразующих единиц).

Прямая инокуляция. После внесения в питательную среду содержимого испытуемого контейнера или контейнеров ту же среду инокулируют небольшим количеством жизнеспособных микроорганизмов (не более 100 колониеобразую-щих единиц).

В обоих случаях используют штаммы микроорганизмов, приведенные выше, в описании испытания питательных свойств в отношении аэробов, анаэробов и грибов. За положительный контроль принимают результаты испытания питатель­ных свойств используемых сред. Все контейнеры, содержащие среду, инкубируют не более 5 дней.

Если после периода инкубации ясно наблюдается рост микроорганизмов, визуально сравнимый с ростом в контрольном сосуде, не содержащим испытуемо­го продукта, делают вывод, что либо продукт в условиях испытания не обладает антимикробной активностью, либо такая активность была в достаточной степени исключена. В таком случае испытание на стерильность может проводиться без дальнейших модификаций.

Если после периода инкубации не наблюдается роста микроорганизмов, ви­зуально сравнимого с ростом в контрольном сосуде, не содержащим испытуемого продукта, делают вывод, что продукт обладает антимикробной активностью, кото­рая в условиях испытания не была в достаточной степени исключена. Условия подвергают модификациям с целью исключения антимикробной активности и по­вторяют испытание на пригодность.

Это испытание следует проводить в следующих случаях:

а) когда проводится испытание на стерильность новой продукции,

б) при внесении любых изменений в экспериментальные условия испытания.

Проверка пригодности может выполняться одновременно с контролем сте­рильности испытуемой продукции.

# Частные фармакопейные статьи должны содержать сведения о наличии антимикробного действия продукта и рекомендации по его устранению.

ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ ТЕСТИРУЕМОГО ПРОДУКТА

Испытание может быть выполнено с использованием метода мембранной фильтрации или путем прямой инокуляции питательной среды испытуемым про­дуктом. Должны проводиться соответствующие отрицательные контрольные опы­ты. В тех случаях, когда позволяет природа продукта (фильтруемые водные пре­параты, спиртовые или масляные препараты, а также препараты, смешиваемые или растворимые в водных или масляных растворителях, не обладающих анти­микробным эффектом в условиях испытания), следует предпочитать метод мем­бранной фильтрации.

Мембранная фильтрация. Используют мембранные фильтры с номиналь­ным размером пор, не превышающим 0,45 мкм, с установленной способностью к удерживанию бактерий. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы ис­пользуют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов, а фильтры на основе ацетата целлюлозы - в частности, для растворов с высоким содержа­нием спирта. Для некоторых видов продукции, например, для антибиотиков, могут потребоваться специально подготовленные фильтры.

В нижеописанном методе предполагается использование мембран диамет­ром около 50 мм. При использовании фильтров других диаметров объемы разве­дений и промывок должны быть изменены соответствующим образом. Аппарат для фильтрации и мембрану стерилизуют подходящим способом. Конструкция ап­парата должна обеспечивать введение и фильтрацию испытуемого раствора в асептических условиях, извлечение мембраны для ее переноса в питательную среду или проведение инкубации после помещения питательной среды в аппарат.

Водные растворы. Небольшое количество подходящего стерильного рас­творителя, не подавляющего рост микроорганизмов, например, нейтрального рас­твора мясного или казеинового пептона концентрацией 1 г/л (рН 7,1 ± 0,2), поме­щают на мембрану аппарата и фильтруют. Растворитель может содержать подхо­дящие нейтрализующие и/или инактивирующие вещества, например, в случае ан­тибиотиков.

Содержимое контейнера или контейнеров, подлежащих испытанию, пере­носят на мембрану (мембраны), при необходимости, после разбавления до объе­ма, используемого в испытании на пригодность, избранным стерильным раство­рителем; в любом случае, используют количества испытуемого продукта не менее указанных в Таблице 2.6.1.-2. Немедленно фильтруют. Если испытуемый раствор обладает антимикробными свойствами, мембрану не менее трех раз промывают путем пропускания через нее каждый раз объема выбранного стерильного рас­творителя, указанного в испытании на пригодность. В процессе промывки объем не должен превышать 5x200 мл, даже если при проверке пригодности было пока­зано, что такая промывка не полностью исключает антимикробную активность. Мембрану целиком переносят в питательную среду или в асептических условиях делят ее на две равные части, каждую из которых помещают в две подходящие среды. Используют такие же объемы питательных сред, как и в испытании на при­годность. Кроме того, среда может быть нанесена на мембрану в аппарате. Среды инкубируют в течение не менее 14 дней.

Минимальные количества тестируемого продукта, используемые для каждой пи­тательной среды

Количество в контейнере	Минимальное количество, которое следует использовать для посева на каждую среду, если не обосновано и разрешено использование других ко­личеств
Для жидкостей
Менее 1 мл	Все содержимое каждого контейнера
1 - 40 мл	Половина содержимого каждого кон­тейнера, но не менее 1 мл
Более 40 мл, но не более 100 мл	20 мл
Более 100 мл	10% содержимого контейнера, но не менее 20 мл
Для жидкостей, содержащих антибиоти­ки	1 мл
Для других препаратов, растворимых в воде или в изопропилмиристате	Все содержимое каждого контейнера, составляющее не менее 200 мг
Нерастворимые препараты, кремы и ма­зи, подлежащие суспендированию или эмульгации	Все содержимое каждого контейнера, составляющее не менее 200 мг
Для твердых веществ
Менее 50 мг	Все содержимое каждого контейнера
50 мг и более, но менее 300 мг	Половина содержимого каждого кон­тейнера, но не менее 50 мг
От 300 мг до 5 г	150 мг
Более 5 г	500 мг

Твердые растворимые препараты. Для каждой среды используют количе­ство продукта, растворенного в подходящем растворителе, например, растворе натрия хлорида 0,9% или нейтральном растворе мясного или казеинового пептона концентрацией 1 г/л, не менее указанного в Таблице 2.6.1.-2, и продолжают испы­тание по методике, описанной выше для водных растворов, с использованием мембраны, соответствующей выбранному растворителю.

Масла и масляные растворы. Для каждой среды используют количество продукта не менее указанного в Таблице 2.6.1.-2. Масла и масляные растворы, обладающие достаточно низкой вязкостью, могут быть подвергнуты фильтрова­нию через сухую мембрану без разбавления. Вязкие масла могут быть при необ­ходимости разбавлены подходящим стерильным растворителем, для которого по­казано отсутствие антимикробной активности в условиях испытания, например, изопропилмиристатом. Дают маслу проникнуть в мембрану под действием собст­венной тяжести, затем фильтруют, постепенно увеличивая давление или вакуум. Мембрану промывают путем фильтрования не менее трех порций по 100 мл под­ходящего стерильного растворителя, например, нейтрального раствора мясного или казеинового пептона концентрацией 1 г/л, содержащего подходящий эмульга­тор в концентрации, приемлемость которой была подтверждена в ходе испытания на пригодность, например, 10 г/л полисорбата 80. Мембрану или мембраны пере­носят в питательную среду или среды (или наоборот) в соответствии с указания-

ми, приведенными выше для водных растворов, и инкубируют при таких же тем­пературах в течение тех же промежутков времени.

Мази и кремы. Для каждой среды используют количество продукта, не ме­нее указанного в Таблице 2.6.1.-2. Мази на жирной основе и водно-масляные эмульсии могут быть разбавлены до содержания 1% изопропилмиристатом, как описано выше, при необходимости, при нагревании до температуры, не превы­шающей 40⁰С. В исключительных случаях может оказаться необходимым нагрев до температуры, не превышающей 44⁰С. Фильтруют насколько возможно быстро и продолжают испытание в соответствии с указаниями, приведенными выше для масел и масляных растворов.

Прямая инокуляция питательной среды. Количество испытуемого препа­рата, предписанное в таблице 2.6.1.-2, помещают непосредственно в питательную среду. При этом объем продукта должен составлять не более 10% объема среды, если не предписано иное.

Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, испыта­ния выполняют после нейтрализации подходящим нейтрализующим агентом или путем разбавления в достаточном количестве питательной среды. При необходи­мости использования большого объема продукта предпочтительнее использовать концентрированную питательную среду, приготовленную с учетом последующего разбавления. Если это удобно, концентрированная среда может быть добавлена непосредственно к продукту в контейнере.

Масляные жидкости. Используют среды с добавкой подходящего эмульга­тора в концентрации, приемлемость которой была подтверждена в ходе испыта­ния на пригодность, например, 10 г/л полисорбата 80.

Мази и кремы. Готовят разбавлением в соотношении около 1:10 путем эмульгирования с использованием избранного эмульгатора в подходящем сте­рильном растворителе, например, растворе мясного или казеинового пептона концентрацией 1 г/л. Разбавленный продукт переносят в среду, не содержащую эмульгатора.

Инокулированную среду инкубируют в течение не менее 14 дней. Состоя­ние культур оценивают несколько раз в течение инкубационного периода. Иноку-лированные среды, содержащие масляные продукты, ежедневно осторожно встряхивают. Однако, при использовании тиогликолевой или другой аналогичной среды для определения анаэробных микроорганизмов, встряхивание или пере­мешивание сводят к минимуму для поддержания анаэробных условий.

НАБЛЮДЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Время от времени в течение периода инкубации, а также по его завершении оценивают наличие макроскопических признаков микробного роста в средах. Если внесение испытуемого материала приводит к помутнению питательной среды, вследствие чего наличие или отсутствие микробного роста не может быть легко определено визуально, следует через 14 дней после начала инкубации перенести порции среды (каждая объемом не менее 1 мл) в другие сосуды, содержащие свежую аналогичную среду и инкубировать исходные сосуды и сосуды с перене­сенными порциями в течение 4 дней.

Если признаков микробного роста не обнаруживается, то продукт признают выдерживающим испытание на стерильность. При наличии признаков микробного роста продукт не выдерживает испытание на стерильность, если не может быть показано путем повторного испытания или другим способом, что результаты ис­пытания не являются достоверными по причинам, не связанным с испытуемым продуктом. Результаты испытания могут быть признаны недостоверными лишь при выполнении не менее одного из нижеперечисленных условий:

а) данные микробиологического мониторинга зоны проверки стерильности указы- вают на произошедшие сбои,

б) проверка методики, используемой в данном испытании, привела к обнаружению недочетов,

в) в отрицательном контроле был обнаружен микробный рост,

г) после установления типа микроорганизмов, выделенных в ходе испытания, рост этого штамма (этих штаммов) может быть однозначно приписан ошибкам, вноси- мым материалами и/или методиками, используемыми при проведении испытания.

Если результаты испытания признаны недостоверными, испытание повто­ряют, используя то же количество образцов, что и в первоначальном тесте.

Если признаков микробного роста в ходе повторного испытания не обнару­живается, то продукт признают выдерживающим испытание на стерильность. Ес­ли в ходе повторного испытания обнаруживается рост, то продукт не выдерживает испытание на стерильность.

ПРИМЕНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ К ПАРЕНТЕРАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ, ОФТАЛЬМО­ЛОГИЧЕСКИМ И ДРУГИМ НЕИНЪЕКЦИОННЫМ ПРЕПАРАТАМ, ДЛЯ КОТОРЫХ ТРЕБУЕТСЯ ВЫПОЛНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

При использовании метода мембранной фильтрации используют, где это возможно, все содержимое контейнера, но не менее количеств, указанных в Таб­лице 2.6.1.-2, при необходимости разбавляя приблизительно до 100 мл подходя­щим стерильным раствором, например, нейтральным раствором мясного или ка­зеинового пептона концентрацией 1 г/л.

При использовании метода прямой инокуляции питательной среды исполь­зуют количества, указанные в Таблице 2.6.1.-2, если не оправдано и не разрешено применение других количеств. Испытания на стерильность в отношении бактерий и грибов выполняют на одном и том же образце испытуемого продукта. В случа­ях, когда объем или количество, содержащиеся в контейнере, являются недоста­точными для проведения испытаний, для инокуляции различных сред используют содержимое двух или более контейнеров.

Более 100, но не более 500 контейнеров	10 контейнеров
Более 500 контейнеров	2%, но не более 20 кон­тейнеров
Офтальмологические и другие неинъекционные препараты
Не более 200 контейнеров	5%, но не менее 2 контей­неров
Более 200 контейнеров	10 контейнеров
В случаях, когда продукция представлена в форме контейнеров, содержащих одну дозу, применяют указанную выше схему для парентеральных препа­ратов
Большие объемы твердых субстанций
До 4 контейнеров	Каждый контейнер
Более 4, но не более 50 контейнеров	20%, но не менее 4 кон­тейнеров
Более 50 контейнеров	2%, но не менее 10 кон­тейнеров
Большие упаковки антибиотиков (более 5 г)	6 контейнеров
* Если содержимого одного контейнера достаточно для инокуляции двух сред, то в данной колонке дано количество контейнеров, необходимое для обеих сред.

УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ИСПЫТАНИЯ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

Цель испытания на стерильность, как и всех фармакопейных испытаний, за­ключается в предоставлении независимым аналитикам средств проверки соот­ветствия данного материала требованиям Фармакопеи. Производителю не вме­няется в обязанность проводить такие испытания и не запрещается использовать модификации установленного метода или альтернативные методы при условии, что данная продукция будет соответствовать требованиям Фармакопеи при про­ведении испытания с использованием официального метода.

Условия проведения испытаний. Асептические условия проведения ис­пытания могут быть достигнуты, например, использованием камеры с ламинар­ным потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или с помощью изолятора.

Руководство для производителей. Уровень достоверности, подтвер­ждаемый удовлетворительным результатом испытания на стерильность (отсутст­вие загрязняющих единиц в образце), в отношении к качеству партии зависит от ее однородности, условий производства и эффективности принятого плана отбора проб. Для целей данного описания партия определяется как однородный набор запечатанных контейнеров, приготовленных таким образом, чтобы риск микробно­го загрязнения был одинаковым для каждой единицы.

Для продукции, стерилизуемой на последней стадии производства, биоло­гически обоснованные и автоматически документированные фактические доказа­тельства правильного протекания процесса стерилизации для всей партии дают большую гарантию, по сравнению с испытанием на стерильность. Обстоятельст­ва, при которых допустим параметрический выпуск серии, описаны в разделе «Методы приготовления стерильной продукции» (5.1.1). Для подтверждения асеп­тических условий производства может применяться метод наполнения питатель­ными средами. За исключением этих ситуаций, испытание на стерильность явля­ется единственным аналитическим методом для продукции, производство которой осуществляется в асептических условиях.

Вероятность определения наличия микроорганизмов в ходе испытания на стерильность возрастает с увеличением их количества в испытуемом образце и варьируется в зависимости от способности к росту имеющихся микроорганизмов. Вероятность обнаружения очень низких уровней микробного загрязнения, даже если оно в пределах партии является однородным, весьма мала. Интерпретация результатов испытания на стерильность основывается на предположении, что со­держимое любого контейнера в партии, если он будет подвергнут испытанию, даст одинаковый результат. Поскольку очевидно, что каждый контейнер не может быть подвергнут испытанию, следует использовать соответствующий план отбора проб. В случае асептического производства рекомендуется отбирать образцы в начале и в конце выпущенной партии, а также после существенного вмешатель­ства в технологический процесс.

Руководство, касающееся минимального рекомендуемого количества об­разцов, отбираемых для проведения испытания, в зависимости от размера пар­тии, приведено в таблице 2.1.6.-3. При использовании этих рекомендаций следует учитывать объем препарата в контейнере, валидацию метода стерилизации и лю­бые другие особые условия, касающиеся планируемой стерильности продукции.

Наблюдение и интерпретация результатов. Общепринятые микробиоло­гические и биохимические методы в общем случае являются удовлетворительны­ми для идентификации микроорганизмов, выделяемых в ходе испытания на сте­рильность. Однако, если производитель желает использовать лишь критерий (d) для признания результатов испытания на стерильность недостоверными, может оказаться необходимым использование чувствительных методов классификации для демонстрации идентичности микроорганизма, выделенного при испытании продукции, - микроорганизму, выделенному из материалов и окружающей обста­новки. Хотя с помощью рутинных микробиологических и биохимических методов может быть показано, что два изолированных штамма не являются идентичными, эти методы могут быть недостаточно чувствительными и надежными для получе­ния однозначного доказательства того, что два штамма имеют один и тот же ис­точник. Для определения того, что микроорганизмы имеют общее происхождение и клонально связаны, может оказаться необходимым использование более чувст­вительных тестов, например, молекулярной классификации по гомологии

РНК/ДНК.