2.6.18. Испытание живых вирусных вакцин на нейровирулентность

В каждом испытании используют не менее десяти серонегативных по отно­шению к испытуемому вирусу обезьян. Каждой из обезьян в таламический отдел каждого полушария вводят не менее 0,5 мл испытуемого материала, если иное не предписано в частной статье. Общее количество привитого каждой обезьяне ви­руса не должно быть менее количества, содержащегося в рекомендованной еди­ничной человеческой дозе вакцины. Для проверки наличия диких нейровирулент-ных вирусов контрольную группу, состоящую не менее чем из четырех обезьян, содержат в тех же клетках, что и группу привитых обезьян, или в непосредствен­ной близости от них. Привитых обезьян наблюдают в течение 17-21 дней, отме­чая возникновение паралича и других неврологических симптомов; обезьян из контрольной группы наблюдают в течение того же периода и дополнительно 10 дней. Животные, погибшие в течение первых 48 часов после инъекции, считаются погибшими по причинам неспецифического характера и могут быть заменены дру­гими. Результаты испытания признают недостоверными, если: более 20% приви­тых обезьян погибают по неспецифическим причинам; образцы сыворотки, ото­бранные у обезьян контрольной группы, в момент прививки испытуемых животных и через 10 дней после умерщвления последних, имеют признаки инфекции, вы­званной диким вирусом испытуемого типа или вирусом кори. По окончании перио­да наблюдения выполняют вскрытие и гистопатологическое изучение соответст­вующих отделов мозга на предмет наличия воздействия на центральную нервную систему. Материал выдерживает испытание, если не обнаруживается неожидан­ных клинических и гистопатологических признаков воздействия на центральную нервную систему, которые могут быть вызваны введенным вирусом.

2.6.19. Испытание пероральной вакцины полио­миелита на нейровирулентность

Обезьяны, используемые в испытании на нейровирулентность, должны со­ответствовать требованиям, приведенным в частной статье «Вакцина полиомие­лита, пероральная (0215)» и иметь массу тела не менее 1,5 кг. Патогенность для обезьян семейств Macaca или Cercopithecus испытывается в сравнении с патоген-ностью стандартного вирусного препарата для испытания на нейровирулентность путем введения в поясничный отдел центральной нервной системы после седа-ции с использование подходящего агента, например, гидрохлорида кетамина. Для образца сыворотки, отобранного до инъекции, должно быть показано отсутствие нейтрализующих антител в разведении 1:4 при испытании против не более, чем 1000 CCID₅₀ каждого из трех типов полиовируса.

Количество обезьян. Вакцину и подходящий гомотипический вирус срав­нения испытывают одновременно в одной и той же группе обезьян. Вакцину и препарат сравнения вводят равному количеству животных. Животных с разли­чающимися типами введенного препарата размещают случайным образом по клеткам, а их принадлежность кодируется таким образом, чтобы тип полученной ими прививки был скрыт от наблюдателей. Количество привитых обезьян должно быть таково, чтобы при оценке как вакцины, так и препарата сравнения было включено не менее одиннадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу типов 1 и 2, и не менее восемнадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу типа 3 (положительными считают обезьян, имеющих специфические ней­ронные повреждения, вызванные полиовирусом в центральной нервной системе). С одним и тем же гомотипическим стандартом могут испытываться несколько пар­тий вакцины. По возможности, используют обезьян из одной и той же карантинной группы. В других случаях используют обезьян из двух групп, причем вакцина и препарат сравнения прививаются равному количеству обезьян из каждой группы. Если испытание проводится в течение двух рабочих дней, в каждый из дней вак­циной и гомотипическим препаратом сравнения прививают равное количество обезьян.

Содержание вируса. Содержание вируса в вакцине и гомотипическом пре­парате сравнения регулируют таким образом, чтобы они были насколько возмож­но близки и находились в пределах от 10⁵⁵ до 10⁶⁵ CCID₅₀ в 0,1 миллилитре.

Наблюдение. Всех обезьян наблюдают в течение 17-22 дней, отмечая признаки полиомиелита или других вирусных инфекций. Обезьян, выживших в те­чение первых 24 часов, но погибших до 11-го дня после прививки, подвергают вскрытию для определения того, являлся ли причиной гибели полиомиелит. Жи­вотные, погибшие по причинам, не связанным с полиомиелитом, не учитываются при оценке результатов. Умирающих и в тяжелой степени парализованных живот­ных умерщвляют и вскрывают. Также вскрывают всех животных, выживших в те­чение периода наблюдения. Результаты испытания считают недостоверными, ес­ли более, чем у 20% животных в течение периода наблюдения была обнаружена интеркуррентная инфекция.

Количество срезов, подлежащих испытанию. Гистологическому иссле­дованию подлежат, как минимум, поясничный и шейный отделы, верхний и ниж­ний продолговатый мозг, средний мозг, зрительный бугор и двигательная область коры головного мозга каждой обезьяны. Отбирают препараты толщиной 15 мкм и окрашивают их галлоцианином. Минимальные количества подлежащих испыта­нию срезов составляют:

1. 12 срезов, репрезентативных для поясничного утолщения,

2. 10 срезов, репрезентативных для шейного утолщения,

1. 2 среза продолговатого мозга,

2. 1 срез моста и мозжечка,

3. 1 срез среднего мозга,

4. 1 срез с левой и правой части зрительного бугра,

5. 1 срез с левой и правой части двигательной области коры головного мозга.

Подсчет вирусной активности. Для оценки вирусной активности в полу­секциях поясничного корда и ствола мозга используют систему подсчета тяжести повреждений, по которой следующим образом дифференцируют клеточную ин­фильтрацию и разрушение нейронов:

1. Наличие лишь клеточной инфильтрации (обезьяна не считается положи­тельной),

2. Клеточная инфильтрация с минимальным повреждением нейронов,

3. Клеточная инфильтрация со значительным повреждением нейронов,

4. Массовое повреждение нейронов в сочетании или без клеточной инфильт­рации.

Полученные значения записывают на стандартном бланке (пример подхо­дящей формы имеется в разделе «Требования к вакцине полиомиелита (перо-ральной)» в Требованиях к биологическим субстанциям №7 Всемирной организа­ции здравоохранения). Обезьяна, на срезах тканей которой имеются поврежден­ные нейроны, но не имеется игольчатых трактов, считается положительной. Обезьяна, на срезах тканей которой имеются игольчатые тракты, но не имеется поврежденных нейронов, не считается положительной. Срезы, на которых имеют­ся повреждения травматического происхождения, но не имеется специфических вирусных повреждений, при подсчете не учитываются.

Уровни тяжести повреждений основаны на данных, полученных при изуче­нии полусекций поясничных (L), шейных (C) и мозговых (B) гистологических сре­зов. Для каждой положительной обезьяны рассчитывают уровень повреждений (LS) по формуле

LS

Суммарное число L Число полусекций

+

Суммарное число С Число полусекций

+

Суммарное число С Число полусекций

3:

Для каждой группы положительных обезьян рассчитывают среднее значе­ние уровня повреждений.

Оценка. Сравнение вирусной активности в вакцине и в препарате сравне­ния основано на активности в поясничном расширении корда и степени распро­странения активности из этого региона в шейное расширение и головной мозг. Положительное или отрицательное решение основано на общем уровне для всех животных, подвергнутых испытанию. Необычно высокая активность как в пояснич­ном отделе, так и в результате распространения из этого региона, обнаруженная у отдельных животных, также должна приниматься во внимание при вынесении окончательного решения. Моновалентный материал выдерживает испытание, ес­ли имеется требуемое количество положительных животных и если ни в одном из клинических и гистопатологических исследований не выявлено существенных различий в патогенности между вирусом вакцины и препаратом сравнения. Кри­терии положительного решения приведены ниже.

Критерии. Для каждой из вакцин сравнения (типов 1, 2 и 3) проводят под­ходящее количество (например, четыре) квалификационных испытаний на виру­лентность с целью получения данных об активности этих вакцин как основы кри­териев для оценки испытуемых вакцин. Для повторных испытаний каждого из стандартных вирусов вычисляют общий средний уровень повреждений (М), а так­же суммарную оценку дисперсии (s²) и отклонения (s) результатов испытания.

Критерии достоверности результатов испытания препарата сравнения ус­танавливаются на основе данных, накопленных в квалификационных испытаниях. Общепринятых критериев не имеется; для лабораторий с ограниченным опытом работы может быть полезен следующий эмпирический метод установления до­пустимых пределов среднего уровня повреждений для препарата сравнения (Xref):

Если средний уровень повреждений испытуемой вакцины равен X_test, а C₁, C₂ и C₃ - константы, определенные ниже, то:

Вакцина не выдерживает испытание при:

Вакцина может быть однократно подвергнута повторному испытанию при:

Если вакцина испытывается повторно, средние значения уровней повреж­дений для испытуемой вакциной и препаратом сравнения рассчитываются заново. Вакцина не выдерживает испытание при:

X _- X

^л (testl+test2) ^л (ref 1+ref 2) > ^

2 > ³

Константы C1, C2 и C3 вычисляют по формулам:

2s^

C 2 = 2,6^

2s^

где :

N -

N2 -

2,3 -

2.6 - 1.6

C

2s^

N 2

3 = 1,6

количество положительных обезьян при испытании вакцины, количество положительных обезьян в двух испытаниях, нормальное отклонение для 1% уровня, нормальное отклонение для 0,5% уровня, нормальное отклонение для 5% уровня.

Испытание на нейровирулентность, в котором получен средний уровень по­вреждений препарата сравнения (X-ef), несовместимый с предшествующим опы­том, не используется для оценки испытуемой вакцины. Если результаты испыта­ния достоверны, вычисляют средний уровень повреждений для испытуемой вак­цины (Xtest) и сравнивают его с соответствующим значением для гомотипической стандартной вакцины.

20. АНТИ-А И АНТИ-В ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ (НЕПРЯМОЙ МЕТОД)

Готовят два серийных разведения испытуемого препарата в растворе на­трия хлорида R концентрацией 9 г/л. К каждому разведению одного ряда добав­ляют равный объем суспензии эритроцитов группы А₁ концентрацией 5 объемных процентов, предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида. К каж­дому разведению другого ряда добавляют равный объем суспензии эритроцитов группы В концентрацией 5 объемных процентов, предварительно трижды промы­тых раствором натрия хлорида. Суспензии инкубируют при температуре 37⁰С в течение 30 минут, затем клетки трижды промывают раствором натрия хлорида. Клетки оставляют в контакте с поливалентным антиреагентом человеческого им­муноглобулина в течение 30 минут. Каждую из суспензий, не подвергая центрифу-гировангию, исследуют под микроскопом на агглютинацию.

21. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИ­СЛОТ

1. ВВЕДЕНИЕ

Методы амплификации нуклеиновых кислот основаны на двух различных подходах:

1. Амплификация последовательности-мишени нуклеиновой кислоты с ис­пользованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (ЛЦР) или изотермической амплификации рибонуклеиновой кислоты

(РНК).

2. Амплификация сигнала гибридизации с использованием, например, для дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) метода разветвленной ДНК (bDNA). В этом случае амплификация сигнала достигается без подвергания нуклеиновой ки­слоты повторяющимся циклам амплификации.

В данном общем разделе в качестве стандартного метода описывается ме­тод ПЦР. Могут применяться и альтернативные методы, если они выдерживают требования к качеству, перечисленные ниже.

2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

В данном разделе устанавливаются требования к подготовке образца, к ам­плификации in vitro последовательностей ДНК и к детектированию специфическо­го продукта ПЦР. С помощью ПЦР могут быть детектированы определенные по­следовательности ДНК. Последовательности РНК могут также быть детектирова­ны путем обратной транскрипции РНК на комплементарную ДНК (cDNA) с после­дующей амплификацией.

3. ПРИНЦИП МЕТОДА

ПЦР представляет собой процедуру, позволяющую производить в условиях in vitro амплификацию сегментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции на

cDNA).

После денатурации двунитевой ДНК в однонитевую два синтетических оли-гонуклеотидных праймера противоположной полярности спариваются с их соот­ветствующими комплементарными последовательностями в подлежащей ампли­фикации ДНК. Короткие двунитевые участки, формирующиеся в результате спе­цифического спаривания оснований праймеров и комплементарной ДНК-последовательности, образуют границы амплифицируемого сегмента ДНК и слу­жат начальными точками для синтеза ДНК in vitro с участием термостабильной ДНК-полимеразы.

Процесс амплификация ДНК состоит из циклов, включающих:

• тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты (последовательности-мишени) на две отдельные нити;

• специфический отжиг последовательности-мишени с праймерами в подходящих реакционных условиях;

• наращивание праймеров, присоединенных к обеим отдельным нитям, под воз­действием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез ДНК).

Повторяющиеся циклы тепловой денатцурации, отжига с праймерами и синтеза ДНК приводят к экспоненциальной амплификации сегмента ДНК, ограни­ченного праймерами.

Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть опре­делен разнообразными методами соответствующей специфичности и чувстви­тельности.

4. ИСПЫТУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ

В связи с высокой чувствительностью ПЦР, образцы должны быть опти­мальным образом защищены от попадания извне последовательностей-мишеней. Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого материала производят в условиях, минимизирующих деградацию последовательности-мишени. В случае проведения испытания на РНК-последовательности, необходимо принять особые меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному воздействию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реа­генты, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказывать влияние на ход определения.

5. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ