2.6.17. Испытание на антикомплементарную ак­тивность иммуноглобулина

Для определения антикомплементарной активности (АКА) иммуноглобулина определенное количество испытуемого материала (10 мг иммуноглобулина) под­вергают инкубации с определенным количеством комплемента морских свинок (20 СН50), после чего титруют остаток комплемента; антикомплементарная активность выражается как поглощение комплемента, в процентах к контрольному образцу комплемента, принимаемому за 100%.

За гемолитическую единицу активности комплемента (СН50) принимают та­кое его количество, которое в данных реакционных условиях приводит к лизису 2,5х10⁸ из общего количества 5х10⁸ оптимальным образом сенсибилизированных эритроцитов.

Основной раствор магния и кальция. 1,103 г хлорида кальция R и 5,083 г хлорида магния R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворите­лем.

Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г хлорида натрия R и 25,48 г барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение рН до 7,3 1М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного рас­твора кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мем­бранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 4⁰С в стеклянных контейне­рах.

Раствор желатина. 12,5 г желатина растворяют приблизительно в 800 мл воды R и нагревают на водяной бане до кипения. Охлаждают до 20⁰С и разбавля­ют до 10 л водой R. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 4⁰С. Использованию подлежат только прозрачные растворы.

Раствор цитрата. 8,0 г цитрата натрия R, 4,2 г хлорида натрия R и 20,5 г глюкозы R растворяют в 750 мл воды R. Доводят значение рН до 6,1 раствором лимонной кислоты R концентрацией 100 г/л и разбавляют водой R до 1000 мл.

Буферный раствор желатина и барбитала. 4 объема раствора желатина добавляют к 1 объему основного буферного раствора барбитала и перемешива­ют. При необходимости доводят значение рН до 7,3, используя 1 М раствор гид-роксида натрия или 1 М хлористоводородную кислоту. Хранят при 4⁰С. Еже­дневно готовят свежие растворы.

Стабилизированная овечья кровь. Смешивают равные объемы овечьей крови и раствора цитрата и перемешивают. Хранят при 4⁰С не менее 7 и не более 28 дней. (Стабилизированная овечья кровь и эритроциты овцы доступны в раз­личных коммерческих источниках).

Гемолизин. Антисыворотку против красных кровяных телец овцы готовят с использованием кроликов. (Такие антисыворотки доступны в различных коммер­ческих источниках).

Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугировани­ем при температуре около 4⁰С. Сыворотку хранят в небольших количествах при температуре ниже -70⁰.

МЕТОД

Приготовление стандартизированной 5% суспензии эритроцитов ов­цы. Эритроциты овцы отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной овечьей крови, промывают не менее трех раз буферным рас­твором желатина и барбитала и готовят в том же растворе суспензию с содержа­нием клеток 5 объемных процентов. Плотность клеток в суспензии определяют следующим образом: 0,2 мл добавляют к 2,8 мл воды R и центрифугируют лизи-рованный раствор 5 минут при 1000 g; плотность клеток соответствует требовани­ям, если оптическая плотность (2.2.25) супернатанта при 541 нм составляет 0,62±0,01. Плотность клеток корректируют добавлением буферного раствора же­латина и барбитала в соответствии с формулой:

V, = ^,

0,62

где :

V_f - окончательный объем после коррекции, Vj - исходный объем,

А - оптическая плотность исходной суспензии при 541 нм.

Суспензия после коррекции содержит около 1х10⁹ клеток в миллилитре. Титрование гемолизина

Готовят разведения гемолизина в соответствии с Таблицей 2.6.17.-1.

10	0,90	неразбавленный	0,1
75	1,80	7,5	0,2
100	1,80	10	0,2
150	1,00	75	1,0
200	1,00	100	1,0
300	1,00	150	1,0
400	1,00	200	1,0
600	1,00	300	1,0
800	1,00	400	1,0
1200	1,00	600	1,0
1600	1,00	800	1,0
2400	1,00	1200	1,0
3200*	1,00	1600	1,0
4800*	1,00	2400	1,0
*1,0 мл смеси отбрасывают

К каждой пробирке из серии разведении гемолизина, начиная с разведения 1:75, добавляют по 1,0 мл 5% суспензии эритроцитов овцы и перемешивают. Ин­кубируют при 37⁰С в течение 30 минут.

По 0,2 мл каждой из этих инкубированных смесей переносят в новые про­бирки и добавляют по 1,10 мл буферного раствора желатина и барбитала и по 0,2 мл разбавленного комплемента морских свинок (например, в разведении 1:150). Эти операции выполняют дважды.

В качестве контрольного образца негемолизированных клеток готовят три пробирки, содержащие по 1,4 мл буферного раствора желатина и барбитала и 0,1 мл 5% суспензии эритроцитов овцы.

В качестве полностью гемолизированного контрольного образца готовят три пробирки, содержащие по 1,4 мл воды R и 0,1 мл 5% суспензии эритроцитов овцы.

Все пробирки инкубируют при 37⁰С в течение 60 минут и центрифугируют 5 минут при 1000 g. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) супернатантов при 541 нм и вычисляют для каждой из пробирок степень гемолиза, в процентах, по фор­муле:

A - A

^{A A} х100, A_b - A

где :

А_а - оптическая плотность в пробирках с разведениями гемолизина,

А_ь - средняя оптическая плотность в трех пробирках с полным гемолизом,

А1 - средняя оптическая плотность в трех пробирках без гемолиза.

На миллиметровой бумаге строят график зависимости степени гемолиза в процентах (по оси ординат) от обратного значения соответствующего разведения гемолизина (по оси абсцисс). Определяют из графика оптимальное разведение гемолизина. Выбирают разведение таким образом, чтобы дальнейшее увеличе­ние количества гемолизина не приводило бы к существенному изменению степени гемолиза. Это разведение принимают за одну минимальную гемолитическую еди­ницу (1 МГЕ) в 1,0 мл. Оптимальное гемолитическое разведение гемолизина для приготовления сенсибилизированных эритроцитов овцы составляет 2 МГЕ/мл.

Результат титрования гемолизина считают достоверным при условии, что максимальная степень гемолиза составляет от 50 до 70%. Если максимальная степень гемолиза не находится в этих пределах, титрование повторяют с исполь­зованием более или менее разбавленного раствора комплемента.

Приготовление оптимизированных сенсибилизированных эритроци­тов (гемолитической системы).

Готовят подходящий объем разбавленного гемолизина с содержанием 2 МГЕ/мл и равный объем стандартизированной 5% суспензии эритроцитов овцы. Добавляют разведение гемолизина к стандартизированной суспензии клеток и пе­ремешивают. Инкубируют при 37⁰С в течение 15 минут, после чего хранят при температуре от 2⁰С до 8⁰С и используют в течение 6 часов.

Титрование комплемента

Готовят подходящее разведение комплемента (например, 1:250) с исполь­зованием буферного раствора желатина и барбитала и выполняют титрование в двух повторностях в соответствии с Таблицей 2.6.17.-2.

К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,2 мл сенсибилизирован­ных эритроцитов овцы, хорошо перемешивают и инкубируют при 37⁰С в течение 60 минут. Пробирки охлаждают на ледяной бане и центрифугируют 5 минут при 1000 g. Измеряют оптическую плотность супернатанта при 541 нм и вычисляют степень гемолиза (Y) по формуле:

A_c - A Ab - 4'

А_с - оптическая плотность в пробирках 1-12,

Ль - средняя оптическая плотность в пробирках со 100% гемолизом, А1 - средняя оптическая плотность в контролях с 0% гемолизом.

На миллиметровой бумаге с логарифмическим масштабом по обеим осям строят график со значениями Y/(1-Y) на оси абсцисс и количеством разведенного комплемента на оси ординат. Строят наилучшую прямую, соответствующую нане­сенным точкам и определяют ординату для дозы комплемента, приводящей к 50% гемолизу, т.е. Y/(1-Y) = 1,0. Вычисляют активность, в гемолитических единицах (СН50/мл) по формуле:

C_d C_a ■ 5 ^,

где :

C_d - обратное значение разведения комплемента, Са - объем, в мл, разведенного комплемента, приводящий к 50% гемолизу,

5 - масштабный множитель для учета количества эритроцитов.

Испытание на антикомплементарную активность

Готовят разведение комплемента, содержащее 100 СН50/мл, путем разбав­ления титрованного комплемента морских свинок буферным раствором желатина и барбитала. При необходимости, доводят значение рН испытуемого иммуногло­булина до 7. Для иммуноглобулина с содержанием 50 мг/мл готовят следующие смеси для инкубации:

Проводят испытание испытуемого образца иммуноглобулина и готовят по­ложительный и отрицательный контроли АКА с использованием стандартного об­разца человеческого иммуноглобулина BRP, в соответствии с указаниями на ли­стке-вкладыше, сопровождающем стандартный препарат. Если концентрация им­муноглобулина отличается от 50 мг/мл, используют большие либо меньшие объ­емы образца и буферного раствора желатина и барбитала; например, при концен­трации иммуноглобулина 30 мг/мл, к 0,33 мл его раствора добавляют 0,47 мл бу­ферного раствора желатина и барбитала с получением 0,8 мл. Пробирки укупори­вают и инкубируют при 37⁰С в течение 60 минут. По 0,2 мл каждой из инкубиро­ванных смесей добавляют к 9,8 мл буферного раствора желатина и барбитала для разбавления комплемента. Вышеописанную операцию титрования компле­мента проводят для каждой из пробирок, определяя остаточную активность ком­племента (Таблица 2.6.17.-2). Антикомплементарную активность испытуемого препарата вычисляют относительно контроля комплемента, принимаемого за 100%, по формуле:

a - b

100,

a

где :

а - средняя активность комплемента, в СН50/мл, в контролях комплемента,

ь - активность комплемента, в СН50/мл, в испытуемом образце. Результаты испытания считают достоверными, если

- антикомплементарные активности, определенные для АКА-отрицательного и АКА-положительного контролей находятся в пределах, указан­ных в листке-вкладыше, сопровождающем стандартный образец,

- активность комплемента в контроле комплемента (а) находится в преде­лах от 80 до 120 СН50/мл.