2.7.11. Количественное определение фактора свертывания крови человека IX

Активность определяют путем сравнения количества испытуемого препарата, необходимого для уменьшения времени свертывания испытуемой смеси, содержащей вещества, отличные от фактора IX, принимающие участие в процессе коагуляции, и количества препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для получения такого же эффекта.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата фактора свертывания крови человека IX. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Восстанавливают по отдельности испытуемый препарат и препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке и используют немедленно. В случае необходимости, определяют количество присутствующего гепарина (2.7.12) и нейтрализуют гепарин добавлением протамина сульфата R (10 мкг протамина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Испытуемый препарат и препарат сравнения разбавляют количеством имидазольного буферного раствора рН 7,3 R, достаточным для получения растворов с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл. Готовят двукратные разведения в диапазоне от 1:10 до 1:80 с использованием смеси 1 объема раствора натрия цитрата R концентрацией 38 г/л и 5 объемов имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Разведения производят с высокой точностью и используют немедленно.

В определении могут использоваться, например, инкубационные пробирки, температура которых поддерживается с помощью водяной бани на уровне 37⁰С. В каждую пробирку помещают по 0,1 мл субстрата плазмы R2 и по 0,1 мл одного из разведений испытуемого препарата или препарата сравнения. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или заменителя тромбоцитов R и 0,1 мл суспензии 0,5 г легкого каолина R в 100 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Пробирки выдерживают около 10 минут, время от времени переворачивая. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл раствора кальция хлорида R концентрацией 7,4 г/л. С использованием секундомера измеряют время коагуляции, т.е. интервал времени между добавлением хлорида кальция и первыми признаками образования фибрина, которые можно определять либо визуально, либо с применением соответствующей аппаратуры. Вычисляют активность с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).

Для подтверждения отсутствия в субстрате плазмы R2 существенного количества фактора IX выполняют контрольный опыт с использованием вместо испытуемого препарата соответствующего количества смеси 1 объема раствора натрия цитрата R концентрацией 38 г/л и 5 объемов имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Результаты испытания считают достоверными, если время коагуляции в контрольном опыте составляет от 100 до 200 секунд.