5.1. Предотвращение загрязнения

В связи с риском загрязнения следует строго разграничивать рабочие зоны в зависимости от используемых материалов и применяемой технологии. Учиты­ваемые факторы включают передвижение персонала, использование спецодеж­ды, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации.

Систему следует разделить на такие отсеки, как:

• зона основной смеси (зона, в которой работы осуществляются только с материа­лами, не содержащими шаблонных последовательностей, например, праймерами, буферными растворами и т.д.),

• пре-ПЦР (зона, в которой ведется работа с реагентами, образцами и контроля­ми),

• ПЦР -амплификация (амплифицируемый материал содержится в закрытой сис­теме),

• пост-ПЦР детектирование (единственная зона, в которой операции с амплифи-цируемым материалом производятся в открытой системе).

2. Подготовка образцов

При подготовке образцов подлежащая амплификации последовательность-мишень должна быть эффективным и воспроизводимым образом экстрагирована или высвобождена из испытуемого материала так, чтобы амплификация в из­бранных реакционных условиях была осуществима. Могут быть использованы различные физико-химические процедуры экстракции и/или обогащения.

Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влия­ние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале следует провести процедуры, описанные в пункте 7.3.2.

В случае РНК-матриц следует уделять внимание предотвращению прояв­ления рибонуклеазной активности.

3. Амплификация

Амплификация последовательности-мишени методом ПЦР проводится в опти­мизированных циклически изменяющихся условиях (температурный профиль для денатурации двунитевой ДНК, отжига и наращивания праймеров; периоды инку­бации при выбранных температурах; скорость наращивания). Эти условия зависят от различных параметров, например:

• длины и состава праймера и последовательности-мишени;

• типа ДНК-полимеразы, буферной смеси и реакционного объема, используемых при амплификации;

• типа используемого устройства для термоциклирования и скорости передачи тепла между аппаратом, реакционным сосудом и реакционной жидкостью.

5.4 Детектирование

Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, может быть идентифицирован по размеру, последовательности, путем химической модификации или комбина­цией этих методов. Характеризация по размеру может быть проведена методами гель-электрофореза (с использованием слоев агарозного или полиакриламидного гелей или капиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (напри­мер, ВЭЖХ). Характеризация по составу последовательности может быть прове­дена путем специфической гибридизации зондов, содержащих последователь­ность, комплементарную мишени, или расщеплением амплифицированного мате­риала, отражающим наличие мишень-специфических сайтов ферментативной ре­стрикции. Характеризация по химической модификации может быть проведена, например, введением в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуо­ресценции, возникающей в результате возбуждения.

6. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат испытания является достоверным лишь при условии получе­ния однозначно положительных результатов для положительного контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для отрицательного контроля (контролей). В связи с исключительно высокой чувствительностью метода ПЦР и с риском попадания загрязняющих примесей, положительные ре­зультаты должны подтверждаться двукратным полным повторением проце­дуры испытания, по возможности, с новой аликвотой образца. Считают, что образец дает положительную реакцию, если не менее одного из повторных ис­пытаний дает положительный результат.

7. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА