2.6.16. Испытания на посторонние агенты в ви­русных вакцинах для медицинского применения

Если для проведения испытания требуется предварительная нейтрализа­ция вируса, используют специфические антитела, не происходящие от человека или обезьян; если выращивание вируса производилось на тканях птичьего проис­хождения, то антитела не должны, кроме того, происходить от птиц. Для приго­товления антисыворотки используют иммунизирующий антиген, произведенный клеточной культурой, имеющей происхождение, отличное от происхождения вак­цины, и не содержащей посторонних агентов. Если предписано использование яиц SPF, яйца отбирают из групп, не содержащих указанные патогены (5.2.2).

ВИРУСНЫЙ ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ

Образцы вирусного посевного материала отбирают во время его сбора и, если их не подвергают испытанию немедленно, хранят при температуре ниже -

40⁰С.

Половозрелые мыши. Каждой из не менее 10 половозрелых мышей мас­сой от 15 до 20 г вводят интрацеребрально 0,03 мл и внутрибрюшинно 0,5 мл ви­русного посевного материала. Мышей наблюдают в течение не менее 21 дня. Производят вскрытие всех мышей, погибших или имеющих симптомы заболева­ния по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их на наличие призна­ков вирусной инфекции как путем прямого макроскопического осмотра, так и пе­репрививкой подходящих суспензий тканей интрацеребральным и внутрибрюшин-ным методами дополнительно не менее, чем пяти мышам, которых наблюдают в течение 21 дня. Вирусный посевной материал выдерживает испытание, если ни одна мышь не обнаруживает симптомов инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% привитых мышей выживают в течение периода наблюдения.

Новорожденные мыши. Каждой из не менее 20 мышей возрастом менее 24 часов вводят интрацеребрально 0,01 мл и внутрибрюшинно не менее 0,1 мл вирусного посевного материала. Мышей наблюдают ежедневно в течение не ме­нее 14 дней. Производят вскрытие всех мышей, погибших или имеющих симптомы заболевания по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их на нали­чие признаков вирусной инфекции как путем прямого макроскопического осмотра, так и перепрививкой подходящих суспензий тканей интрацеребральным и внутри-брюшинным методами дополнительно не менее, чем пяти новорожденным мы­шам, которых наблюдают ежедневно в течение 14 дней. Вирусный посевной ма­териал выдерживает испытание, если ни одна мышь не обнаруживает симптомов инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты испы­тания считают достоверными, если не менее 80% привитых мышей выживают в течение периода наблюдения.

Морские свинки. Каждой из не менее 5 морских свинок массой от 350 до 450 г вводят внутрибрюшинно 5,0 мл вирусного посевного материала. Животных наблюдают в течение не менее 42 дней, отмечая наличие симптомов заболева­ния. Производят вскрытие всех морских свинок, погибших или имеющих симптомы заболевания по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их макроско­пически; ткани исследуют как микроскопически, так и культурально, отмечая нали­чие признаков инфекции. Животных, выживших в течение периода наблюдения, умерщвляют и исследуют аналогичным образом. Вирусный посевной материал выдерживает испытание, если ни одна морская свинка не обнаруживает призна­ков инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% морских свинок выживают в течение периода наблюдения.

ВИРУСНЫЙ ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ И ВИРУСНЫЕ СБОРЫ

Образцы отбирают во время сбора и, если их не подвергают испытанию немедленно, хранят при температуре ниже -40⁰С.

Бактериальная и грибковая стерильность. Образец объемом 10 мл дол­жен выдерживать испытание на стерильность (2.6.1).

Микоплазмы. Образец объемом 10 мл должен выдерживать испытание на микоплазмы (2.6.7).

Микобактерии (2.6.2). Образец объемом 5 мл подвергают испытания на наличие Mycobacterium spp. методами культивирования, обладающими известной чувствительностью в отношении определения этих организмов.

Испытание клеточной культуры на другие посторонние агенты. Ней­трализованные образцы, эквивалентные 500 человеческим дозам, но не менее 50 мл, если иные количества не предписаны в частной статье, испытывают на при­сутствие посторонних агентов путем введения в непрерывные почечные обезья­ньи и человеческие клеточные культуры. Если вирус выращен на человеческих диплоидных клетках, нейтрализованный вирусный сбор также испытывают на от­дельной культуре диплоидных клеток. Если вирус вакцины выращен не на чело­веческой либо обезьяньей клеточной системе, то производят также инокуляцию клеток данного вида из отдельной партии. Клетки инкубируют при температуре 36±1⁰С и наблюдают в течение 14 дней. Вирусный посевной материал или сбор выдерживает испытание, если ни в одной из клеточных культур не обнаруживает­ся признаков любых посторонних агентов, не внесенных в результате случайной контаминации. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80% клеточных культур остаются жизнеспособными.

Птичьи вирусы (требуется только для вирусов, выращенных на тканях птичьего происхождения). Нейтрализуют образец, эквивалентный 100 челове­ческим дозам, но не менее 10 мл. Используя по 0,5 мл на каждое яйцо, инокули-руют группу оплодотворенных яиц SPF возрастом от 9 до 11 дней аллантоисным путем, а другую группу, возрастом от 5 до 7 дней, - в желточный мешок. Инкуби­руют в течение 7 дней. Вирусный посевной материал или сбор выдерживает ис­пытание, если в аллантоисных жидкостях и жидкостях желточных мешков не об­наруживаются гемагглютинирующие агенты и если ни один из эмбрионов и хорио-аллантоисных мембран не обнаруживает макроскопической патологии. Результа­ты испытания считают достоверными, если не менее 80% привитых яиц выживают в течение 7 дней.

ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА: КОНТРОЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Контрольные клетки изучают под микроскопом на отсутствие любой цитопа-тической дегенерации вирусного происхождения. Изучение проводят в течение периода инкубации, но не менее, чем в течение 14 дней после инокуляции. Ре­зультаты испытания считают достоверными, если не менее 80% контрольных кле­точных культур выживают в течение периода наблюдения.

В момент последнего сбора вирусов, но не ранее, чем на 14-й день, выпол­няют нижеописанные испытания.

Испытание на гемадсорбирующие вирусы. Не менее 25% контрольных культур испытывают на наличие гемадсорбирующих вирусов путем добавления эритроцитов морских свинок. При необходимости, эритроциты морских свинок можно хранить при температуре 5±3⁰С в течение не более 7 дней. Состояние по­ловины культур оценивают после инкубации при температуре 5±3⁰С в течение 30 минут, а состояние другой половины - после инкубации при температуре от 20 до 25⁰С в течение 30 минут. Признаков присутствия гемадсорбирующих агентов не должно обнаруживаться.

Испытание клеточных культур на другие посторонние агенты. Собира­ют супернатанты контрольных клеток и испытывают на присутствие посторонних агентов путем введения в почечные обезьяньи и человеческие клеточные культу­ры. Если вирус вакцины выращен не на человеческой или обезьяньей клеточной системе, то производят также инокуляцию клеток данного вида, но из отдельной партии. На каждой клеточной системе испытывают не менее 5 мл. Инокулирован-ные культуры инкубируют при температуре 36±1⁰С и наблюдают в течение 14 дней. Признаков присутствия посторонних агентов не должно обнаруживаться.

Если производственная клеточная культура поддерживается при темпера­туре, отличной от 36±1⁰С, выполняют дополнительное испытание на посторонние агенты при этой температуре с использованием клеток того же типа, который ис­пользуется для выращивания вируса.

КОНТРОЛЬНЫЕ ЯЙЦА

Гемагглютинирующие агенты. По 0,25 мл аллантоисной жидкости каждого из яиц испытывают на гемагглютинирующие агенты путем непосредственного смешивания с куриными красными кровяными тельцами и после засева яиц SPF, выполняемого следующим образом: инокулируют объединенный образец амнио-тических жидкостей общим объемом 5 мл в аллантоисную и амниотическую по­лости яиц SPF. Объемы введения - по 0,5 мл. Контрольные яйца выдерживают испытание, если ни в одном случае не обнаруживаются признаки присутствия ге-магглютинирующих агентов.

Вирусы птичьего лейкоза. Используют образец объединенных амниоти-ческих жидкостей контрольных яиц общим объемом 10 мл. Проводят усиление пу­тем пяти пассажей на клеточных культурах куриных эмбрионов, не содержащих вирусов лейкоза; испытание на птичий лейкоз выполняют с использованием кле­ток, полученных в пятом пассаже. Контрольные яйца выдерживают испытание, если не обнаруживается признаков присутствия вирусов лейкоза.

Другие посторонние агенты. Образцы объединенных амниотических жид­костей контрольных яиц по 5 мл прививают на человеческие и обезьяньи клеточ­ные культуры. Клеточные культуры наблюдают в течение 14 дней. Контрольные яйца выдерживают испытание, если не обнаруживается признаков присутствия посторонних агентов. Результаты испытания считают достоверными, если не ме­нее 80% привитых культур выживают до окончания периода наблюдения.