2.5.13. Алюминий в адсорбированных вакцинах

Испытуемое вещество гомогенизируют и переносят соответствующее количество, содержащее от 5 мг до 6 мг алюминия, в колбу для сжигания вместимостью 50 мл. Прибавляют 1 мл серной кислоты Р, 0,1 мл азотной кислоты Р и несколько стеклянных шариков. Нагревают полученный раствор до его помутнения из-за выделяющегося белого дыма. Если на данной стадии наблюдается обугливание, прибавляют несколько капель азотной кислоты Р и продолжают кипячение до исчезновение окраски. Смесь охлаждают несколько минут, с осторожностью добавляют 10 мл воды Р и кипятят до получения прозрачного раствора. Охлаждают, прибавляют 0,05 мл метилового оранжевого раствор Р и нейтрализуют натрия гидроксида раствором концентрированным Р (6,5 мл на 7 мл). Если образуется осадок, его растворяют, добавляя по каплям достаточный объем серной кислоты разведенной Р. Переносят раствор в коническую колбу вместимостью 250 мл, остатки в колбе для сжигания смывают 25 мл воды Р. Прибавляют 25,0 мл 0,02 М раствора натрия эдетата, 10 мл ацетатного буферного раствора рН 4,4 Р, несколько стеклянных шариков и осторожно кипятят в течение 3 мин, добавляют 0,1 мл пиридилазонафтола раствор Р и титруют горячий раствор 0,02 М раствором меди сульфата до изменения цвета раствора на пурпурно-коричневый.

Испытания повторяют без использования вакцины.

1 мл 0,02 М раствора натрия эдетата соответствует 0,5396 мг Al.

2.5.14. Кальций в адсорбированных вакцинах

Все растворы, используемые для данного исследования должны готовится с использованием воды Р .

Кальций определяют атомно-эмиссионной спектрометрией (2.2.22, метод 1). Исследуемое лекарственное средство гомогенизируют. К 1,0 мл прибавляют 0,2 мл кислоты хлористоводородной разведенной Р и разводят до 3,0 мл водой Р. Измеряют интенсивность излучения при длине волны 620 нм.

15. ФЕНОЛ В ИММУНОСЫВОРОТКАХ И ВАКЦИНАХ

Исследуемое лекарственное средство гомогенизируют. Разводят до необходимого объема водой Р, чтобы получить раствор, содержащий 15 мкг/мл фенола. Готовят ряд стандартных растворов с фенолом Р, содержащих 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг и 30 мкг/мл фенола соответственно. К 5 мл исследуемого раствора и к 5 мл каждого стандартного раствора прибавляют 5 мл буферного раствора рН 9,0 Р, 5 мл раствора 1 г/л аминопиразолона Р и 5 мл раствора 50г/л калия ферроцианида Р. Дают отстояться 10 мин и измеряют интенсивность окрашивания при длине волны 546 нм.

Строят градуировочный график и рассчитывают содержание фенола в лекарственном средстве.

16. БЕЛОК В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Используют мерную колбу необходимого объема для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида. Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до объема водой Р. Помещают 1 мл раствора в стеклянную пробирку и добавляют 0,15 мл раствора 400 г/л кислоты трихлоруксусной Р. Встряхивают, дают отстояться 15 мин, центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 5000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляют 0,4 мл 0,1 M раствора натрия гидроксида Р.

Стандартные растворы. Разводят 0,100 г альбумина бычьего Р в 100 мл 0,1 M натрия гидроксида (основной раствор, содержащий 1 г/л белка). Разводят 1 мл основного раствора до 20 мл 0,1 M раствором натрия гидроксида Р (рабочий раствор 1 с концентрацией белка 50 мг/л). Разводят 1 мл основного раствора до 4 мл 0,1 M раствором натрия гидроксида Р (рабочий раствор 2 с концентрацией протеина 250 мг/л). В 6 стеклянных пробирок помещают 0,10 мл, 0,20 мл и 0,40 мл рабочего раствора 1 и 0,15 мл, 0,20 мл и 0.25 мл рабочего раствора 2. доводят объем в каждой пробирке до 0,40 мл, используя 0,1 M раствор натрия гидроксида

Р.

Готовят контрольный раствор, используя 0,40 мл 0,1 M раствор натрия гидроксида Р

В каждую пробирку добавляют 2 мл раствора медно-тартратногоо Р встряхивают и дают отстояться в течение 10 мин. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл смеси равных объемов фосфомолибденовольфрамового реактива Р и воды Р, приготовленной непосредственно перед использованием. Закрывают пробирки, перемешивают, переворачивают их и дают отстояться в темном месте в течение 30 мин. Голубой цвет остается стабильным в течение 60 мин. При необходимости центрифугируют для получения прозрачных растворов.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны 760 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Строят градуировочный график на основе оптической плотности 6 стандартных растворов и соответствующей концентрации белка и сравнивают с графиком показателей белка в исследуемом растворе.

17. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до необходимого объема водой Р. При необходимости разводят исследуемый раствор до достижения оптической плотности, подходящей к используемому прибору. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) при длине волны 260 нм, используя воду Р в качестве раствора сравнения.

Оптическая плотность раствора 1 г/л нуклеиновой кислоты при длине волны 260 нм равна 20.

18. ФОСФОР В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема. Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до объема водой Р. Разводят раствор так, чтобы объем, используемый в опыте (1 мл), содержал около 6 мкг фосфора. Переносят 1,0 мл раствора в пробирку на 10 мл из термостойкого стекла.

Стандартные растворы. 0,2194 г калия дигидрофосфата Р разводят в 500 мл воды Р таким образом, чтобы концентрация раствора была равна 0,1 мг/мл фосфора. 5,0 мл раствора разводят до 100,0 мл водой Р. Переносят 0,5 мл, 1,0 мл и 2,0 мл разведенного раствора в три пробирки из термостойкого стекла. Готовят контрольный раствор, используя 2,0 мл воды Р в пробирке из термостойкого стекла.

Во все пробирки добавляют 0,2 мл кислоты серной Р и подогревают на масляной бане при 120 C в течение 1 ч, а затем при 160 C до появления белого дыма (около 1 ч). Прибавляют 0,1 мл кислоты хлорной Р и нагревают при 160°C до обесцвечивания раствора (около 90 мин). Охлаждают и прибавляют в каждую пробирку 4 мл воды очищенной и 4 мл реактива аммония молибдата Р. Нагревают на водяной бане при 37 C в течение 90 мин и охлаждают. Доводят объем до 10,0 мл с помощью воды Р. Голубой цвет остается стабильным в течение нескольких часов.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны 820 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Строят градуировочный график на основе оптической плотности трех стандартных растворов и соответствующей концентрации фосфора и сравнивают с оптической плотностью исследуемого раствора.

19. О-АЦЕТИЛ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема. Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до необходимого объема водой Р. Раствор разводят так, чтобы объемы, используемые в опыте, содержали от 30 мкг до 600 мкг ацетилхолин хлорида (О-ацетил). Помещают 0,3 мл, 0,5 мл и 1,0 мл по два раза в 6 пробирок (3 реагирующих раствора и 3 корректирующих раствора).

Стандартные растворы. Растворяют 0,150 г ацетилхолин хлорида Р в 10 мл воды Р (основной раствор, содержащий 15 г/л ацетилхолин хлорида). Непосредственно перед использованием разводят 1 мл основного раствора до 50 мл водой Р (рабочая концентрация 1 - 300 мкг/мл ацетилхолин хлорида). Непосредственно перед использованием разводят 1 мл основного раствора до 25 мл водой Р (рабочая концентрация 2 - 600 мкг/мл ацетилхолин хлорида). Помещают 0,1 мл и 0,4 мл рабочей концентрации 1 дважды (реагирующий и корректирующий растворы) в 4 пробирки и 0,6 мл и1,0 мл рабочей концентрации 2 дважды (реагирующий и корректирующий растворы) в другие 4 пробирки.

Готовят контрольный раствор, используя 1 мл воды Р.

Доводят объем в каждой пробирке до 1 мл водой Р. Добавляют 1,0 мл 4 М раствора кислоты хлористоводородной в каждую из корректирующих пробирок и в контрольную пробу. Добавляют 2,0 мл щелочного раствора гидроксиламина Р в каждую пробирку. Дают пройти реакции в течение 2 мин и добавляют в каждую из пробирок с реагирующим раствором 1 мл 4 М раствора кислоты хлористоводородной. Прибавляют 1,0 мл раствора 100 г/л железа хлорида Р в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной в каждую пробирку, закрывают пробирки пробками и сильно встряхивают для удаления пузырьков.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны 540 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Для каждого реагирующего раствора вычитают оптическую плотность соответствующего корректирующего раствора. Строят градуировочный график на основании скорректированных оптических плотностей для 4 стандартных растворов и соответствующего содержания ацетилхолин хлорида и сравнивают с графиком содержание ацетилхолин хлорида в исследуемом растворе для каждого исследуемого объема. Рассчитывают среднее по трем величинам.

1 моль ацетилхолин хлорида (181,7 г) соответствует 1 молю О-ацетила (43,05

г).