2.7.9. Определение функционального состояния Fc-фрагмента иммуноглобулина

Стабилизированная человеческая кровь. Человеческую кровь группы 0 собирают в антикоагулянтный раствор ACD. Стабилизированную кровь хранят при 4⁰С не более 3 недель.

Раствор хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. 1,022 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,336 г безводного натрия дигидрофосфата R и 8,766 г натрия хлорида R растворяют в 800 мл воды R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.

Основной раствор магния и кальция. 1,103 г кальция хлорида R и 5,083 г магния хлорида R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворителем.

Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г натрия хлорида R и 25,48 г барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение рН до 7,3 1 М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного раствора кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 4⁰С в стеклянных контейнерах.

Буферный раствор альбумина и барбитала. 0,150 г бычьего альбумина R растворяют в 20 мл основного буферного раствора барбитала и разбавляют водой R до 100 мл.

Раствор дубильной кислоты. 10 мг дубильной кислоты R растворяют в 100 мл раствора хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. Готовят непосредственно перед использованием.

Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугированием при температуре около 4⁰С. Сыворотку хранят в небольших количествах при температуре ниже -70⁰. Непосредственно перед началом гемолиза, инициируемого комплементом, разбавляют буферным раствором альбумина и барбитала до содержания 125-200 СН50 в миллилитре и хранят в процессе испытания на ледяной бане.

# СН₅₀ (гемолитическая единица активности комплемента) - концентрация комплемента в контрольной сыворотке, вызывающая в данных реакционных условиях теста агглютинации лизис 50% эритроцитов.

Антиген краснухи. Соответствующий антиген краснухи для титрования по ингибированию гемагглютинации (HIT). Титр должен составлять более 256 НА-единиц.

Приготовление таннированных человеческих эритроцитов. Эритроциты отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной человеческой крови. Промывают клетки не менее трех раз раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2 и суспендируют в том же растворе, получая суспензию концентрацией 2 объемных процента. 0,1 мл раствора дубильной кислоты разбавляют до 7,5 мл раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2 (окончательная концентрация 1,3 мг/л). 1 объем свежеприготовленного разведения смешивают с 1 объемом суспензии эритроцитов и инкубируют при 37⁰С в течение 10 минут. Клетки отделяют центрифугированием (400-800 g в течение 10 минут), супернатант удаляют, а клетки однократно промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. Таннированные клетки снова суспендируют в растворе хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2, получая суспензию концентрацией 1 объемный процент.

Покрытие антигенами таннированных человеческих эритроцитов. К

соответствующему объему (Vs) таннированных клеток добавляют антиген краснухи (0,2 мл на 1,0 мл клеток) и инкубируют при 37⁰С в течение 30 минут. Клетки отделяют центрифугированием (400-800 g в течение 10 минут) и отбрасывают супернатант, оставляя объем 200 мкл. Добавляют буферный раствор альбумина и барбитала, объем которого равен объему отброшенного супернатанта, клетки ресуспендируют и отделяют, как описано выше, и повторяют операцию промывки. Оставшиеся 200 мкл доводят до объема, составляющего % Vs, получая таким образом начальный объем (Vi). 900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала смешивают с 100 мкл V получая таким образом остаточный объем (V_r), и определяют исходную оптическую плотность при длине волны 541 нм (А). V_r разбавляют буферным раствором альбумина и барбитала с коэффициентом разведения, равным А, получая таким образом конечный корректированный объем Vf = V_r х A сенсибилизированных человеческих эритроцитов и значение А десятикратного разведения, составляющее после коррекции 1,0 ± 0,1.

Связывание антителами таннированных человеческих эритроцитов, покрытых антигенами. Готовят последовательность следующих растворов (каждый - в двух повторностях), используя для каждого из них отдельную кювету для полумикроопределений (например, одноразового применения) или пробирку:

1. Испытуемые растворы. При необходимости доводят значение рН испытуемого иммуноглобулина до 7, например, добавлением 1 М раствора гидроксида натрия. Объемы испытуемого препарата, содержащие 30 и 40 мг иммуноглобулина, доводят до 900 мкл буферным раствором альбумина и барбитала.

2. Растворы сравнения. Готовят так же, как и испытуемые растворы с использованием человеческого иммуноглобулина BRP.

3. Контроль комплемента. 900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала.

К содержимому каждой кюветы или пробирки добавляют по 100 мкл сенсибилизированных человеческих эритроцитов и хорошо перемешивают.

Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, добавляют 1000 мкл буферного раствора альбумина и барбитала, отделяют клетки центрифугированием кюветы или пробирки (1000 g в течение 10 минут) и отбрасывают 1900 мкл супернатанта. Добавляют вместо отброшенного супернатанта 1900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала и повторяют всю операцию промывки, оставляя объем 200 мкл. Испытуемые образцы могут храниться в укупоренных кюветах (пробирках) при 4⁰С в течение 24 часов.

Инициируемый комплементом гемолиз. Для измерения степени гемолиза к испытуемому образцу добавляют 600 мкл предварительно нагретого до 37⁰С буферного раствора альбумина и барбитала, осторожно ресуспендируют клетки путем не менее чем пятикратных повторных пипетирований и помещают кювету в термостатированный держатель кювет спектрофотометра. Через 2 минуты добавляют 200 мкл разведенного комплемента морских свинок (125-200 СН50/мл), тщательно перемешивают путем двукратного пипетирования и тотчас же после второго пипетирования начинают регистрацию оптической плотности при длине волны 541 нм в зависимости от времени с использованием в качестве раствора сравнения буферного раствора альбумина и барбитала. Измерение прекращают при очевидном прохождении графиком зависимости оптической плотности от времени точки перегиба.

Оценка. Определяют угол наклона (S) кривой гемолиза в районе точки перегиба путем сегментации участка с наибольшим уклоном на подходящие временные отрезки At (например, At = 1 мин) и вычисляют значения S между соседними точками пересечений, выраженные в АА/мин. Наибольшее значение S принимают за (S_exp). Кроме того, определяют оптическую плотность в начале измерения (As) путем экстраполяции кривой, практически линейной и параллельной оси времени в течение первых нескольких минут. Значение {S_exp) корректируют по формуле:

s

" A

Вычисляют среднее арифметическое значений S' для каждого препарата. Вычисляют индекс функции Fc (Ifc) по формуле:

_т _ 100 ■ (S - Ж)

где:

S' - среднее арифметическое корректированного угла наклона для испытуемого препарата,

S\ - среднее арифметическое корректированного угла наклона для препарата сравнения,

S\ - среднее арифметическое корректированного уклона для контроля комплемента.

Вычисляют индекс функции Fc для испытуемого препарата: значение должно быть не ниже указанного на листке-вкладыше, сопровождающем препарат сравнения.