2.7.10. Количественное определение фактора свертывания крови человека VII

Количественное определение фактора свертывания крови VII производят по его биологической активности в виде комплекса фактора Vila с тканевым фактором при активации фактора Х в присутствии ионов кальция и фосфолипидов. Активность препарата фактора VII оценивают путем сравнения количества, необходимого для достижения определенной скорости образования фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для достижения такой же скорости образования фактора Ха.

За Международную Единицу принимают активность фактора VII в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной из замороженного состояния плазмы. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии. Первая стадия состоит в зависящей от фактора VII активации фактора Х смесью реагентов, включающей тканевый фактор, фосфолипиды и ионы кальция. На второй стадии происходит ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора. Содержание метода количественного определения описывается схемой 2.7.10.-1:

1-я стадия а) Фактор VII

Тканевый фактор + Са⁺⁺

Фактор Vila

b) Фактор Х

Фактор ЛПа + Ca++ + тканевый фактор/фосфолипид

Фактор Ха

2-я стадия хромогенный субстрат

Фактор Ха

пептид + хромофор

Схема 2.7.10.-1. - Схема количественного определения фактора коагуляции крови

человека VII.

В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям.

РЕАГЕНТЫ

Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого или говяжьего происхождения, включающих фактор Х и тромбопластиновый тканевый фактор / фосфолипид в качестве активатора фактора VII. Эти белки подвергнуты частичной очистке и не должны содержать примесей, мешающих активации фактора VII или фактора Х. Фактор Х содержится в количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения, находящейся в пределах от 10 до 350 нмоль/л, предпочтительно от 14 до 70 нмоль/л. В качестве тканевого фактора/фосфолипида может использоваться тромбопластин, полученный из природных источников, например, из мозга крупного рогатого скота или кроликов, или синтетический препарат. Тромбопластин, подходящий для использования в определении протромбинового периода, разбавляют буфером в соотношении от 1:5 до 1:50 так, чтобы окончательная концентрация ионов кальция составляла от 15 до 25 ммоль/л. Образование конечного фактора Ха проводят в растворе, содержащем человеческий или бычий альбумин в концентрации, не допускающей потери адсорбции, и соответствующим образом буферизированного до рН 7,3-8,0. В окончательной инкубационной смеси фактор VII должен быть единственным компонентом, лимитирующим скорость.

Вторая стадия включает количественное определение образовавшегося фактора Ха с использованием специфичного в отношении фактора Ха хромогенного субстрата. Обычно он представляет собой короткий пептид, состоящий из 3-5 аминокислотных остатков, присоединенный к хромофорной группе. При отщеплении этой группы от пептидного субстрата ее хромофорные свойства смещаются к длине волны, при которой становится возможным произвести спектрофотометрическое определение. Субстрат обычно растворяют в воде R и используют в конечных концентрациях 0,2-2 ммоль/л. Субстрат также может содержать подходящие ингибиторы для прекращения дальнейшего образования фактора Ха (добавка эдетата).

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Восстанавливают полное содержимое одной ампулы препарата сравнения и испытуемого препарата путем добавления подходящего количества воды R; используют в течение 1 часа. Восстановленные препараты дополнительно разбавляют прерастворителем, получая растворы с содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл фактора VII.

Готовят дальнейшие разведения испытуемого и стандартного препаратов с использованием изотонического нехелатирующего буфера, содержащего 1% человеческого или бычьего альбумина и предпочтительно буферизированного при рН от 7,3 до 8,0. Готовят не менее трех отдельных, независимых разведений каждого препарата. Предпочтительно каждое из разведений готовить в двух повторностях. Разведения готовят таким образом, чтобы окончательная концентрация фактора VII была ниже 0,005 МЕ/мл.

Готовят контрольный раствор, включающий все компоненты, кроме фактора

VII.

Все разведения готовят в пластиковых пробирках и используют в течение 1 часа.

1. я стадия. Разведения образца сравнения фактора VII и испытуемого препарата смешивают с подходящим объемом предварительно нагретого реагента факторов свертывания крови или со смесью реагентов, его составляющих, и инкубируют смесь в пластиковых пробирках или ячейках планшета при температуре 37⁰С. Концентрации компонентов в процессе образования фактора Ха должны соответствовать спецификациям, приведенным выше, при описании реагентов.

Активацию фактора Х проводят в течение подходящего промежутка времени, предпочтительно прерывая реакцию до достижения концентрацией фактора Ха ее максимального уровня с целью получения удовлетворительной линейной зависимости отклика от дозы. Время активации выбирается также таким образом, чтобы достичь линейного во времени образования фактора Ха. Подходящие периоды активации обычно находятся в пределах от 2 до 5 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом приемлемой линейности зависимости отклика от дозы.

2. я стадия. Активацию прерывают добавлением предварительно нагретого реагента, содержащего хромогенный субстрат. Проводят количественную оценку скорости расщепления субстрата, которая должна находиться в линейной зависимости от концентрации образовавшегося фактора Ха, измеряя изменение оптической плотности при соответствующей длине волны с помощью спектрофотометра. Оптическую плотность отслеживают постоянно, получая таким образом возможность вычислить начальную скорость расщепления субстрата, либо прерывают реакцию гидролиза по окончании подходящего промежутка времени путем понижения рН добавлением подходящего реагента, например, уксусной кислоты (500 г/л С2Н4О2) или раствора цитрата (1 моль/л) с рН 3. Время гидролиза регулируют с целью достижения линейного характера образования хромофора во времени. Подходящими обычно являются периоды гидролиза от 3 до 15 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).