5.2.3. Субстраты клеток для производства вакцин, используемых людьми

Эта общая глава касается диплоидных штаммов культур клеток и перевиваемых линий культур клеток, используемых для производства вакцин для применения людьми; конкретные вопросы, связанные с вакцинами, приготовленными при помощи технологии рекомбинантной ДНК, описываются в монографии «Продукции технологии рекомбинантной ДНК (0784)».

Тестирование, которое должно проводиться на различных этапах (клеточные посевы, контрольный банк культур клеток, рабочий банк культур клеток, клетки на максимальном уровне удваивания популяции или за его пределами, используемые при производстве) приведены в Таблице 5.2.3.-1. Общие условия использования культур и методов тестирования указаны ниже. Требования к использованию для производства вакцины диплоидные линий или клеток, которые прошли несколько пересевов без образования банка культур клеток, содержатся в отдельной монографии о вакцине, о которой идет речь.

Диплоидные штаммы клеток. Диплоидная штаммы клеток обладает высокой, но ограниченной способностью размножения in vitro.

Перевиваемые линии клеток. Перевиваемые линии клеток обладают способностью неограниченного размножения «in vitro»; клетки зачастую имеют различия в кариотипе по сравнению с диплоидными линиями; их можно получить из здоровой ткани или опухоли.

Для вакцин, предназначенных для инъекций, производимых в перевиваемых линиях клеток, в процессе очистки обеспечивается снижение количества клеток-субстратов ДНК до уровня, равного не более 10 нг на одну человеческую дозу, кроме случаев, когда необходимо иное.

Система банк культур клеток. Производство вакцин с использованием диплоидных и перевиваемых линий клеток основано на системе банков культур клеток. Возраст клеток in vitro считается от контрольного банка культур клеток. Каждый рабочий банк культур клеток готовится из одного или нескольких контейнеров контрольного банка культур клеток. Использование, идентификация и управление запасами контейнеров тщательно документируются.

Среды и субстанции животного или человеческого происхождения.

Состав сред, применяемых для изоляции и всей последующей культуры подробно записывается, а применяемые субстанции животного происхождения не должны иметь посторонних примесей.

При использовании человеческого альбумина необходимо обеспечить соответствие монографии «(Раствор человеческого альбумина (0255)».

Бычья сыворотка, применяемая при приготовлении и хранении клеточных культур, должна тестироваться и быть стерильной и не зараженной бычьими вирусами, в особенности вирусом бычьей диареи и микоплазмами.

Трипсин, используемый при приготовлении клеточных культур, должен проверяться и быть стерильным и не зараженным микоплазмами и вирусами, в особенности пестивирусами и парвовирусами

Посев клеток. Данные, необходимые для оценки пригодности посева клеток, включают информацию об источнике, истории и характеристике, где это возможно.

Источник посева клеток. Для человеческих клеточных культур записывается следующая информация о доноре: этническое и географическое происхождение, возраст, пол, общее физиологическое состояние, использованная ткань или орган, результаты каких-либо тестов на наличие патогенов.

Для животных клеточных культур записывается следующая информация об источнике клеток: вид, штамм, условия разведения, географическое происхождение, возраст, пол, общее физиологическое состояние, использованная ткань или орган, результаты каких-либо тестов на наличие патогенов.

Клетки нейронального происхождения, такие как нейробластома и линии клеток Р12, которые могут репродуцироваться возбудителем губчатообразной энцефалопатии (их клетки чувствительны к прионам), не могут быть использованы для производства вакцин.

История посева клеток. Записывается следующая информация: метод, используемый для изоляции посева клеток, и любые другие процедуры, применяемые для создания контрольного банка клеток, в особенности те, которые могут подвергнуть клетки воздействию посторонних веществ.

Возможно, что полная информация об источнике происхождения культуры клеток неизвестна. Где это оправдано и разрешено, банки культур клеток с использованием таких культур, могут применяться в производстве таких вакцин.

Характеристика посева клеток. Следует изучить следующие свойства:

1. природу клеток (например, изоферменты, серология, состав нуклеиновой кислоты);

2. характеристики роста клеток и их морфологические свойства (световые и электронные микроскопы);

3. для диплоидных клеток - кариотип;

4. для диплоидных штаммов клеток - продолжительность жизни in vitro, выраженная в уровне удвоения популяции.

Стабильность субстрата клеток. Необходимо продемонстрировать соответствующую жизнестойкость культур клеток в предполагаемых условиях хранения. Чтобы конкретный продукт мог быть подготовлен в культурах клеток, необходимо продемонстрировать, что последовательное производство может быть достигнуто с клетками на уровнях перехода в начале и в конце предполагаемого срока использования.

Посторонние возбудители инфекций. Культур клеток для производства вакцин не должны иметь посторонних возбудителей инфекций. Тесты на выявление посторонних веществ проводятся, как показано в Таблице 5.2.3.-1.

В зависимости от происхождения и культуральной истории культур клеток может потребоваться провести тесты на конкретные выбранные потенциальные контаминанты, в особенности те, о которых известно, что они инфицируют вид, от которого взяты клетки, в латентной форме, например, обезьяний вирус 40 у макак-резусов. Для культур клеток, произошедших от грызунов, для определения вирусов, характерных для конкретных видов, проводят тесты на выработку антител на мышах, крысах и хомяках.

Ниже описано, как культур клеток анализируются на наличие ретровирусов. Колонии клеток, в которых обнаружено присутствие ретровирусов, способных размножаться, не подходят для производства вакцин.

Опухолеродность. Культура клеток для приготовления живых вакцин не должна вызывать новообразований на любом уровне удвоения популяции, используемом для производства вакцин. Если для производства других типов вакцин используется культур клеток, вызывающая новообразования, процесс очистки должен демонстрировать, что остаточное количество клеток-субстратов ДНК снижено до 10 нг на одну человеческую дозу вакцины, кроме случаев, когда предусмотрено иное, и что количество клеткок-субстратов белка снижено до приемлемого уровня.

Культура клеток, о которой известно, что она может вызывать новообразования, не нуждается в дальнейшем тестировании. Если культур клеток имеет опухолеродный потенциал неизвестного характера, ее либо рассматривают как опухолеродную, либо проверяют на опухолеродность с использованием теста in vitro, описанного ниже. Если результат теста in vitro отрицательный или неопределенно положительный, проводится приведенный ниже тест in vivo. Тесты проводятся с использованием клеток на максимальном уровне удвоения популяции, который будет применяться при производстве вакцин, или за его пределами.

Культуры клеток MRC-5, WI-38 и FRhL-2 признаны неопухолеродными и не требуют дополнительного тестирования.

Хромосомная характеристика. Необходимо доказать, что диплоидный штамм клеток имеет диплоидный набор хромосом. Если удаление неповрежденных клеток во время обработки после сбора не подтвердилось, необходимо провести более детальную характеристику диплоидной колонии клеток при помощи анализа кариотипа. Необходимо исследовать пробы из четырех пересевах, равномерно распределенных по всей протяженности жизни колонии клеток. Для точного подсчета хромосом и частоты гиперплоидии, гипоплоидии, полиплоидии, повреждений и структурных аномалий следует исследовать минимум 200 клеток в метафазе.

Культуры клеток MRC-5, WI-38 и FRhL-2 признаны диплоидными и хорошо охарактеризованными; если они не модифицированы генетически, дополнительные характеристики не требуются.

Таблица 5.2.3.-1. Тестирование колоний клеток

Тест Посев Контрольный Рабочий Клетки на

клеток банк клеток банк максимальном (КБК) культур уровне

клеток удвоения (РБК) популяции, или за его

пределами, используемые

для

производства

1. ПРИРОДА И ЧИСТОТА

Морфология

Соответствующий

выбор из следующих

тестов: биохимический

(например,

изоферменты),

иммунологический

(например,

гистосовместимость),

цитогенетические

маркеры, состав

нулеиновой кислоты

Кариотип (диплоидные колонии клеток)

Продолжительность жизни (диплоидные колонии клеток)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

₊(1)

2. ПОСТОРОННИЕ ВЕЩЕСТВА

Заражение бактериями или грибами

Микоплазмы

Тесты клеточных культур

Совместная культивация

Тесты животных и яиц

Конкретные тесты на возможные загрязняющие вещества в зависимости от происхождения клеток (см. выше пункт «Посторонние возбудители инфекций»

Ретровирусы +

+

_- +(3) 3. ОПУХОЛЕРОДНОСТЬ

+

+ +

+⁽²⁾

+⁽²⁾ +⁽²⁾ ₊(2)

₊(2) ₊(2)

₊(3)

₊(4)

Опухолеродность - - -

⁽¹⁾ Диплоидная природа устанавливается для каждого рабочего банка культур клеток, но с использованием клеток на максимальном уровне удвоения популяции, используемом для производства, или за его пределами.

⁽²⁾ Тестирование проводится для каждого рабочего банка культур клеток, но с использованием клеток на максимальном уровне удвоения популяции, используемом для производства, или за его пределами.

⁽³⁾ Тестирование проводится для контрольного банка культур клеток, но с использованием клеток на максимальном уровне удвоения популяции, используемом для производства, или за его пределами.

⁽⁴⁾ Культура клеток MRC-5, культура клеток WI-38 и культура клеток RFhL-2 признаны неопухолеродными и не требуют тестирования. Тесты не проводятся на колониях клеток, о которых известно или предполагается, что они опухолеродны.

МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Идентификация. Для установления природы клеток примените анализ состава нуклеиновой кислоты и соответствующие из приведенных ниже тестов:

1. биохимические характеристики (изоферментный анализ);

2. иммунологические характеристики (антигены гистосовместимости);

3. цитогенные маркеры.

Контаминация клеток. Анализ состава нуклеиновой кислоты, проводимый для идентификации, служит также для того, чтобы продемонстрировать отсутствие заражающих клеток.

Контаминация бактериями и грибами. Контрольный банк культур клеток и каждый рабочий банк культур клеток должны проходить тест на стерильность (2.6.1.), выполняемый с использованием 10 мл надосадочной жидкости из клеточных культур для каждого средства. Тест должен проводиться на 1 % контейнеров, но как минимум на 2 контейнерах.

Микоплазмы (2.6.7.). Контрольный банк культур клеток и каждый рабочий банк культур клеток должны проходить тест на микоплазмы культуральным методом и методом клеточной культуры-индикатора. В тесте должны участвовать один или несколько контейнеров.

Тесты на микроорганизмы-контаминанты. Клетки должны проходить тест на гемадсорбирующие вирусы и тесты клеточных культур на другие посторонние вещества, приведенные в главе 2.6.16 под заголовком «Производственная клеточная культура: контрольные клетки». Если клетки взяты от обезьян, они, кроме того, инокулируются в клеточные культуры печени кролика для выявления реакции на вирус герпеса В (cercopithecid herpesvirus 1).

Совместная культивация. Необходимо культивировать неповрежденные и поврежденные клетки отдельно с другими системами клеток, в том числе человеческих клеток и обезьяньих клеток. Следует проводить исследования для выявления возможных морфологических изменений. Тесты проводятся на жидкостях клеточных культур для обнаружения гемагглютинирующих вирусов. Клетки проходят тест, если не обнаружено доказательств наличия какого-либо постороннего вещества.

Ретровирусы. Проверка присутствия ретровирусов осуществляется с помощью использования:

1. анализов на инфекционность;

2. трансмиссионной электронной микроскопии;

3. если тесты (1) и (2) дали отрицательную реакцию, проводится анализ на обратную транскриптазу (в присутствии магния и марганца) на гранулах, полученных высокоскоростным центрифугированием.

Тесты на животных. Следует ввести внутримышечно (или, для мышей, питающихся молоком матери, подкожно) в каждую из следующих групп животных 10⁷ жизнеспособных клеток, разделенных поровну между животными в каждой группе:

1. два помета детенышей мыши в возрасте менее 24 часов, общим числом не менее 10 животных;

2. десять взрослых мышей.

Следует ввести интрацеребрально в каждую из десяти взрослых мышей 10⁶ жизнеспособных клеток для обнаружения возможного присутствия вируса лимфоцитарного хориоменингита.

Наблюдение за животными осуществляется в течение минимум 4 недель. Следует также обследовать заболевших животных или животных, у которых наблюдаются аномалии, для определения причины заболевания. Клетки проходят тест, если не обнаружено доказательств наличия какого-либо постороннего вещества. Тест считается недействительным, если менее 80% животных в каждой группе остаются здоровыми и доживают до конца периода наблюдения.

Для клеток, полученных от какого-либо вида грызуна (например, клеток яичников китайского хомяка или клеток почек детеныша хомяка), проводятся тесты на антитела на возможных возбудителей вируса у исследуемого вида. Тесты проводятся на животных, которым вводятся клетки.

Тесты на яйцах. Используя посевной материал в количестве 10⁶ жизнеспособных клеток на каждое яйцо, следует ввести клетки в аллантоисную полость десяти НЗКП куриных яиц с эмбрионами внутри (5.2.2) 9-11-дневного возраста и в желточный мешок десяти НЗКП куриных яиц с эмбрионами внутри 5-6-дневной свежести. Выдержать в течение не менее 5 дней. Протестировать аллантоисную жидкость на наличие гемагглютининов, используя эритроциты млекопитающих и птиц; проводить тест при температуре 5 ± 3 °С и 20-25 °С и прочитайте результат через 30 и 60 минут. Клетки проходят тест, если не обнаружено доказательств наличия какого-либо постороннего вещества. Тест считается недействительным, если менее 80 % эмбрионов остаются здоровыми и доживают до конца периода наблюдения.

Тесты на опухолеродность in vitro. Возможно использование следующих систем тестов:

1. формирование колоний в мягком агаровом геле;

2. получение инвазивного роста клеток после инокуляции в культуры органов;

3. исследование трансформационной деятельности с использованием, например, системы анализа 3Т3 для активных онкогенов.

Тесты на опухолеродность in vivo. Тест состоит в сравнительном анализе исследуемой культуры клеток и соответствующим положительным контрольным результатом (например, онкогенных культур HeLa или Hep2).

Системы животных, показавшие себя пригодными для этого теста, включают:

1. атимичных мышей (генотип Nu/Nu);

2. новорожденных мышей, крыс или хомяков, подвергшихся действию антитимоцитной сыворотки или глобулина;

3. облученных мышей с у_- да₊ленной вилочковой железой, получивших костный мозг от здоровых мышей (Т^-, В⁺).

При выборе любой из систем животных культура клеток и базовые клетки вводятся при помощи инъекций в различные группы животных по 10 животных в каждой. В обоих случаях прививочный материал из 10⁷ клеток в виде взвеси объемом 0,2 мл вводится внутримышечно или подкожно. Новорожденным животным вводится 0,1 мл антитимоцитной сыворотки или глобулина на 0, 2, 7 и 14 день после рождения. Сильнодействующая сыворотка или глобулин подавляет иммунные₇ механизмы растущих животных до уровня, при котором последующее введение 10⁷ положительных базовых клеток регулярно вызывает опухоли и метастазы. Животных, которые сильно поражены и у которых наблюдаются признаки постоянно растущих опухолей, следует убивать, не дожидаясь конца теста, чтобы избежать ненужных страданий.

В конце периода наблюдения всех животных, включая базовые группы, убивают и исследуют на наличие макроскопических и микроскопических признаков разрастания привитых клеток в месте инъекции и в других органах (например, лимфатических узлах, легких, почках и печени).

Во всех тестовых системах животных следует наблюдать и ощупывать через регулярные промежутки времени для обнаружения уплотнений в месте инъекции. Любые сформировавшиеся уплотнения необходимо измерять в двух перпендикулярных измерениях и регулярно записывать эти измерения для того, чтобы определить, наблюдается ли прогрессивный рост уплотнений. Животных, у которых в периоде наблюдения уплотнения начинают уменьшаться, убивают до того, как уплотнения перестанут прощупываться, и подвергают гистологическому исследованию. Животные с прогрессивно растущими уплотнениями наблюдаются в течение 1-2 недель. Половина животных, у которых не наблюдается формирования уплотнений, наблюдается в течение 3 недель, а вторая половина - в течение 12 недель до того, как их убивают и подвергают гистологическому исследованию. Каждое животное подвергается вскрытию, которое включает обследование на предмет макроскопических признаков формирования опухолей в месте инъекции и в других органах, таких как лимфатические узлы, легкие, мозг, селезенка, почки и печень. Все опухолеобразные образования в месте инъекции подвергают гистологическому анализу. Кроме того, так как некоторые культуры клеток могут вызвать метастазы без признаков местного роста опухоли, необходимо провести гистологическое исследование всех обнаруживаемых местных лимфатических узлов и легких животных.

Тест считается недействительным, если менее чем у девяти из десяти животных, которым были введены положительные базовые клетки, наблюдаются прогрессивно растущие опухоли.