2.5.34. Уксусная кислота в синтетических пептидах

Исследование проводят методом жидкостной хроматографии (2.2.29). Исследуемый раствор. Готовят исследуемый раствор, как указано в частной статье.

Стандартный раствор. Готовят раствор 0,10 г/л кислоты уксусной ледяной Р в смеси с 5 объемами мобильной фазы B и 95 объемами мобильной фазы A. Хроматографическая процедура может проводиться с использованием:

• колонок из нержавеющей стали длиной 0,25 м и 4,6 мм внутреннего диаметра с неподвижной фызой октадецилсилил силикагелем для хроматографии Р (5 мкм);

— скорость потока мобильной фазы 1,2 мл/мин;

• мобильная фаза A: разводят 0,7 мл кислоты фосфорной Р до 1000 мл водой Р, корректируют pH до 3,0 концентрированным раствором натрия гидроксида Р;

• мобильная фаза B: метанол R2

Время (мин)	Мобильная фаза A (% об/об)	Мобильная фаза B (% об/об)
0 - 5	95	5
5 - 10	95 — 50	5 — 50
10 - 20	50	50
20 - 22	50 — 95	50 — 5
22 - 30	95	5

— спектрофотометрический детектор с длиной волны 210 нм.

Вводят 10 мкл стандартного раствора и 10 мкл исследуемого раствора. В полученных хроматограммах пик, соответствующий уксусной кислоте, имеет время удерживания 3-4 мин. Основная линия представляет собой крутой пик в начале линейного градиента, который соответствует элюированию пептидов из колонки. Определяют содержание уксусной кислоты в пептиде.

# 2.5.35. ТИТРОВАНИЕ В НЕВОДНЫХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

Метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях применяется для количественного определения веществ, представляющих собой кислоты, основания или соли, титрование которых в воде затруднено или невозможно из-за слабых кислотно-основных свойств или малой растворимости.

В неводных растворителях резко изменяются кислотно-основные свойства различных веществ. В зависимости от растворителя одно и то же вещество может быть кислотой, основанием или вообще не проявлять кислотно-основных свойств. Применение различных растворителей позволяет управлять кислотно-основными свойствами веществ.

Выбор растворителя осуществляется на основании величин констант титрования К_Т или их отрицательных логарифмов рК_Т. Величина рК_т является критерием возможности и точности титрования. Чем больше эта величина, тем лучше условия титрования. Константа титрования определяется двумя основными величинами: константой кислотности титруемой кислоты (К_а), или константой кислотности кислоты, сопряженной с титруемым основанием (К_ВН⁺), и константой автопротолиза растворителя (Кзн).

При титровании кислот:

Ё

Ё_д =—^ или рКг = рКзн - рКа;

При титровании оснований:

Ёд = Ё_м + или рКг = рКзН⁺;

При титровании смеси двух кислот:

Ё

Ёд = или рКт = рКа(2) - рКа(1);

^Ёа (1)

При титрования смеси двух оснований:

Ёд = *^{М (1)} или рКт = рКВН⁺(1) - рКВН⁺(2).

' AI + (2)

Ё Ё

Индекс 1 относится к более сильной кислоте (основанию), а индекс 2 - к более слабой кислоте (основанию).

Значения величин рК_зн для ряда растворителей и рК_а кислот и рК_ВН⁺ оснований в воде и различных неводных растворителях приведены в таблицах 2.5.14.-2, 2.5.14.-3, 2.5.14.-4. Эти таблицы позволяют быстро определять рК_Т. Задачу выбора растворителя помогает решить также линейная зависимость рК_Т кислот и оснований, принадлежащих к одной группе химических соединений, в воде и неводных растворителях. Это позволяет определять рК_Т кислот и оснований в неводных растворителях, если известны их рК_Т в воде.

Как кислоты можно титровать: карбоновые кислоты, фенолы, барбитураты, сульфамиды, аминокислоты и другие.

Как основания можно титровать: амины, азотсодержащие гетероциклические соединения, амиды, четвертичные аммониевые основания и другие.

Оптимальные условия титрования для слабых кислот достигаются в основных неводных растворителях, таких как пиридин, диметилформамид; для слабых оснований - в кислотных неводных растворителях, таких как уксусная кислота и уксусный ангидрид.

Соли некоторых органических и минеральных кислот могут быть оттитрованы как основания в кислотных растворителях.

В случае титрования солей галогеноводородных кислот перед титрованием прибавляют обычно раствор ртути (II) ацетата для связывания галогенид-ионов в малодиссоциирующие соединения. При использовании уксусного ангидрида в качестве растворителя возможно титрование солей галогенводородных кислот, преимущественно хлоридов, без прибавления ртути (II) ацетата.

Для раздельного титрования смесей кислот или смесей оснований используют дифференциирующие растворители, т.е. растворители с величиной рК_зн, обычно превышающей 15, не обладающие выраженными кислотно-основными свойствами, такие как кетоны, нитрилы, нитрометан.

В ряде случаев для титрования применяют смеси неводных растворителей, один из которых является апротонным (бензол, хлороформ и др.). Присутствие апротонного растворителя уменьшает константу автопротолиза среды (К), что может способствовать улучшению условий титрования.

Метод неводного титрования применяют также для количественного определения веществ, содержащих карбонильную группу, обладающих слабо выраженными кислотно-основными свойствами и не поддающихся прямому титрованию в неводных растворителях. В этом случае проводят реакцию оксимирования в неводных растворителях и осуществляют количественное определение карбонилсодержащих веществ путем титрования избытка реагента. Метод применяют для количественного определения различных классов органических соединений: альдегидов, кетонов, хромонов, стероидных гормонов, гликозидов и др.

Титрование в неводных средах может быть проведено как с индикаторами, так и потенциометрически с использованием в качестве индикаторного стеклянного или других, обратимых к протону электродов. В качестве электрода сравнения обычно используют хлоридсеребряный электрод.

При проведении потенциометрического титрования в неводных средах электролитический мост или электрод сравнения заполняют растворами калия хлорида или лития хлорида в соответствующих неводных растворителях.

При титровании в основных растворителях следует принимать меры для защиты испытуемого раствора и титрованного раствора от углерода диоксида, содержащегося в воздухе. Титрование лучше проводить в атмосфере инертного газа (азота, гелия).

В Табл. 2.5.14.-1 приведены наиболее часто применяемые неводные растворители, индикаторы и титранты.

К)

ю

ю К) jo

ю

К)

Диметилформамид

to

ho

00

to

ON

b\

to

(O

b\

Диметилсульфоксид

to

00

•to

i (O

'-j

b\

to

Диметилсульфоксид 97%

ON

00

'-j

Диметилацетамид

ON

"4^

'-j

to

^1

Пропиленкарбонат

(О

p

00

(О

b\

ON

to

00

ON

to

b\

Ацетонитрил

(О

^1

b\

(О

lo

Нитрометан

(О

b\

b\

N-метилпирролидон

b\

lo

b\

po

ON

00

(O

b\

00

lo

Пиридин

(О

(О

lo

Жидкий аммиак

Уксусная кислота

to

Муравьиная кислота

lo

Масляная кислота

(О

(О

(О

00

to

Уксусный ангидрид

Антипирин
1,51		8,35	9,60
Кофеин	0,60	5,17		6,30
Теобромин	0,10	5,26		6,10
Мочевина	0,20	4,67	7,65	9,36
Ацетанилид	0,40		6,80

7,30растворителях (рК_вн+= рК sh - рК в = рКт )Таблица2.5.14.-4

5,41							11,40
9,30	6,20
				6,40
	3,20
	6,04