2.7.22. Количественное определение фактора свертывания крови человека XI

Активность фактора свертывания крови человека XI определяют путем сравнения количества испытуемого препарата, необходимого для уменьшения времени свертывания испытуемой смеси, содержащей вещества, отличные от фактора XI, принимающие участие в процессе коагуляции крови, и количества нормальной человеческой плазмы, которое требуется для получения такого же эффекта. 1 единица фактора XI равна активности 1 мл нормальной человеческой плазмы.

Восстанавливают по отдельности испытуемый препарат и препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке и используют немедленно. В случае необходимости, определяют количество присутствующего гепарина (2.7.12) и нейтрализуют гепарин добавлением протамина сульфата R (10 мкг протамина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Испытуемый препарат и препарат сравнения разбавляют количеством имидазольного буферного раствора рН 7,3 R, содержащего 1% альбумина, достаточным для получения растворов с содержанием от 0,5 до 2,0 единиц в миллилитре. Готовят двукратные разведения в диапазоне от 1:10 до 1:80 с использованием имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Разведения производят с высокой точностью и используют немедленно.

В определении могут использоваться, например, инкубационные пробирки, температура которых поддерживается с помощью водяной бани на уровне 37⁰С. В каждую пробирку помещают по 0,1 мл субстрата плазмы R3 и по 0,1 мл одного из разведений испытуемого препарата или препарата сравнения. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или заменителя тромбоцитов R и 0,1 мл суспензии 0,5 г легкого каолина R в 100 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 3,7 г/л. Пробирки выдерживают около 10 минут, время от времени переворачивая. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл раствора хлорида кальция R концентрацией 7,4 г/л. С использованием таймера измеряют время коагуляции, т.е. интервал времени между добавлением хлорида кальция и первыми признаками образования фибрина, которые можно определять либо визуально, либо с применением соответствующей аппаратуры. Вычисляют активность с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).

Для подтверждения отсутствия в субстрате плазмы R3 существенного количества фактора XI выполняют контрольный опыт с использованием вместо испытуемого препарата соответствующего объема имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Результаты испытания считают достоверными, если время коагуляции в контрольном опыте составляет от 100 до 200 секунд.

# 2.7.23 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНСУЛИНА

Активность испытуемого препарата инсулина определят путем сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающего) действия с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина.

Стандартный образец и единица действия инсулина.

Стандартный образец инсулина представляет собой препарат высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем многократного сопоставления с активностью Международного Стандарта и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД) принимают специфическую активность количества массы стандартного образца, эквивалентного по биологическому действию 1 Международной Единице инсулина.

Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и испытуемого препарата инсулина. Точную навеску стандартного образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) с рН 2,7 - 3,0, содержащем консервант в такой же концентрации, как испытуемый препарат.

Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина 4 месяца при температуре 4 ⁰С.

Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина разводят этим же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности.

Метод определения биологической активности.

Определение биологической активности инсулина проводят на здоровых кроликах массой 2,5 - 3,5 кг. Животных массой 1,8 - 2,3 кг предварительно не менее 14 суток содержат в условиях вивария, где они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды, комбинированный корм и воду. По истечении этого срока определяют чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с интервалом 7 - 8 суток после 18 часов голодания вводят подкожно раствор стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела животного и определяют величину снижения концентрации сахара в крови в процентах. Кровь для исследования берут из краевой вены уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 часа после его введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях, не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого метода определения содержания сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые реагируют на введение инсулина судорогами или у которых снижение концентрации сахара в крови составляет менее 15 % по отношению к исходной концентрации. Определение биологической активности инсулина проводят не ранее чем через 7 - 8 суток после испытания на чувствительность.

Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18 часов, предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не менее 9 кроликов). Непосредственно перед введением инсулина кроликов взвешивают и определяют исходную концентрацию сахара в крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по 0,5 ЕД стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам другой группы - такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т). Через 1,5 и 2,5 часа после введения инсулина у животных снова определяют концентрацию сахара в крови.

Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара (X) в крови в процентах по формуле:

X = ^а-Ь х 100 , а

где

а - исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм-процентах;

b - средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм-процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 часа после введения инсулина.

Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину, при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого метода, а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами или дающих снижение концентрации сахара в крови менее 15% по отношению к исходной концентрации.

Через 3 - 5 суток на этих же кроликах проводят повторное испытание с той разницей, что животным из группы, получавшей стандартный образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а животным группы, получавшей (Т), вводят (S).

Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в крови на стандартный образец (% S) и на испытуемый препарат (% Т) по данным всего опыта.

Отношение % Т / %S выражает относительную активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности испытуемого препарата (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А) умножают на R: Т = R • А.

Пример: при определении биологической активности инсулина для инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили следующие величины снижения концентрации сахара в крови в процентах (Y).

Первая часть испытания Вторая часть испытания

Ys	Yt	Yt	Ys
49	48	50	50
61	50	58	51
35	48,5	53	41
55	65	55	55
39	46	39	45
28	22,5	68	60
53	15	38	43
38	48	44	60
50	63	44	56

£ Ys = 869; % S = 869/18 = 48,28.

R = % T / % S = 45,83 / 48,28= 0,949.

£ Yt = 825; % T = 825 / 18 = 45,83.

Активность Т в ЕД, по данным этого опыта, равна:

Т = 0,949 • 40 = 37,96 ЕД в 1 мл.

Определение проводят не менее 2 раз с каждым испытуемым образцом (Т). Среднюю величину при этом получают, объединяя индивидуальные цифры снижения концентрации сахара в крови в процентах в обоих опытах. При расчете окончательного результата должны быть использованы данные, полученные не менее чем на 30 кроликах. Если средняя величина R, по данным двух или большего числа опытов, будет меньше 0,85 или больше 1,15, испытание проводят заново, исходя из новой величины предполагаемой активности испытуемого препарата.

Кролики могут быть использованы повторно для определения биологической активности не ранее чем через 2 недели после окончания предшествующего опыта. Продолжительность использования кроликов в опытах по определению биологической активности инсулина не должна превышать 5 месяцев.

ИСПЫТАНИЕ НА ПРОЛОНГИРОВАННОЕ (УДЛИНЕННОЕ) ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА

Испытание на пролонгированное действие препаратов инсулина основано на сопоставлении длительности гипогликемического эффекта испытуемого препарата и стандартного образца инсулина.

18 здоровых кроликов массой 3 - 4 кг распределяют на две группы по 9 животных способом случайного выбора. Животных содержат в отдельных клетках, за 18 часов до введения инсулина лишают корма (но не воды). В начале опыта у кроликов определяют исходное содержание сахара в крови и рассчитывают среднюю концентрацию сахара в крови для каждой группы. Животным первой группы вводят стандартный образец инсулина, а животным второй группы -испытуемый препарат инсулина. Навеску стандартного образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) рН 2,7 - 3,0, содержащем консервант в такой же концентрации, как и препарат. Доза испытуемого препарата и стандартного образца составляет 0,8 ЕД на 1 кг массы тела животного. Испытуемый препарат вводят в неразведенном виде. Концентрация (количество ЕД в 1 мл) стандартного образца должна быть равна концентрации неразведенного испытуемого препарата. Через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 часов после введения препарата инсулина и стандартного образца определяют концентрацию сахара в крови у кроликов и подсчитывают среднее содержание сахара для каждой группы.

Требования в отношении пролонгированного действия отдельных препаратов инсулина изложены в соответствующих частных статьях.