2.7.7. Количественное определение вакцины коклюша

Активность вакцины коклюша определяют путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты мышей от эффектов летальной дозы Bordetella pertussis, вводимой интрацеребрально, с количеством препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующимся для получения такой же защиты.

За Международную Единицу принимают активность в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной вакцины коклюша. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом менее 5 недель. Разница в массе между самым тяжелым и самым легким животным не должна превышать 5 г. Мышей делят на шесть групп не менее чем по 16 особей и 4 группы по 10 особей. Используют мышей одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного штамма и приготовление суспензии для провокации. Выбирают подходящий штамм B. pertussis, способный привести к гибели мышей в течение 14 дней после интрацеребральной инъекции. Если в течение 48 часов после инъекции погибает более 20% мышей, штамм является неподходящим. Выполняют один пересев штамма и суспендируют собранные B. pertussis в растворе, содержащем 10 г/л гидролизата казеина R и 6 г/л натрия хлорида R, и имеющем показатель рН от 7,0 до 7,2, либо в другом подходящем растворе. Определяют степень мутности суспензии. Готовят ряд разведений с использованием того же раствора и назначают их по одному каждой из групп по десять мышей. Каждой мыши вводят интрацеребрально дозу (0,02 или 0,03 мл) разведения, назначенного группе, к которой она принадлежит. Через 14 дней подсчитывают в каждой группе количество выживших мышей. Из этих результатов вычисляют ожидаемую степень мутности суспензии, содержащей 100 LD50 в каждой провокационной дозе. Для оценки активности испытуемой вакцины производят свежий пересев того же штамма B. pertussis и готовят из собранных организмов суспензию со степенью мутности, соответствующей приблизительно 100 LD50 в каждой провокационной дозе. Готовят 3 разведения провокационной суспензии.

Определение активности. Готовят 3 серийных разведения испытуемой вакцины и 3 аналогичных разведения препарата сравнения так, чтобы для каждого из промежуточных разведений ожидаемая степень защиты мышей от летальных эффектов провокационной дозы B. pertussis составляла 50%. Предлагаемые дозы составляют 1/8, 1/40 и 1/200 доли человеческой дозы испытуемой вакцины и 0,5 МЕ, 0,1 МЕ и 0,02 МЕ препарата сравнения. Каждая из доз содержится в объеме, не превышающем 0,5 мл. 6 разведений назначают по одному каждой из групп, состоящих не менее, чем из 16 мышей, и вводят каждой из мышей внутрибрюшинно одну дозу разведения, назначенного группе, к которой относится данное животное. Через 14-17 дней каждому животному из этих групп вводят интрацеребрально одну дозу суспензии для провокации. Суспензию для провокации и три ее разведения назначают по одному каждой из групп по 10 мышей и вводят каждой из мышей интрацеребрально одну дозу каждой суспензии, назначенной группе, к которой относится данное животное. Мышей, погибших в течение 48 часов после провокации, не учитывают при оценке результатов. В каждой из групп подсчитывают количество мышей, выживающих после 14 дней. Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения на основе количества животных, выживших в каждой из групп из не менее 16 особей.

Результаты испытания являются достоверными, если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,

• количество погибших животных в 4 группах по 10 мышей, которым была введена провокационная суспензия и ее разведения, указывает на то, что провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD50,

• при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.