2.7.15. Количественное определение вакцины гепатита в (rdna)

Количественное определение вакцины гепатита B (rDNA) производят либо in vivo, путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию специфических антител против поверхностного антигена гепатита В (HbsAg) у мышей или морских свинок с такой же способностью препарата сравнения, либо in vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей из одной партии, возрастом около 5 недель. Используемая в данном испытании линия мышей должна обеспечивать получение существенного уклона кривой зависимости отклика от дозы в отношении антигена; подходящими являются мыши гаплотипов H-2^q и H-2^d. Также могут использоваться здоровые морские свинки из одной партии с массой тела от 300 до 350 г и возрастом около 7 недель. Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь равных групп; количество в группе должно быть подходящим для выполнения требований испытания.

Определение активности испытуемой вакцины. Готовят не менее трех серийных разведений испытуемой вакцины и соответствующие разведения препарата сравнения с использованием раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л с добавлением алюминийсодержащего адъюванта, используемого в вакцине, или другого подходящего растворителя. Каждое из полученных разведений назначают одной из групп животных, каждому из которых вводят внутрибрюшинно не более 1,0 мл этого разведения. Одну группу животных не вакцинируют, а вводят внутрибрюшинно такой же объем растворителя. Через подходящий промежуток времени (например, от 4 до 6 недель) всех животных анестезируют и производят забор крови. Индивидуальные сыворотки хранят отдельно друг от друга. Выполняют количественное определение специфических антител против HBsAg в индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод

(2.7.1).

Вычисления. Вычисления проводят обычными статистическими методами, используемыми для количественных определений с конечным числом возможных результатов (5.3).

Из распределения уровней реакции, измеренных для всех сывороток группы невакцинированных животных, определяют максимальный ожидаемый уровень реакции невакцинированного животного в данном количественном определении. При получении отклика, превышающего этот уровень, у вакцинированного животного, его по определению считают результатом сероконверсии.

Производят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование) процентной численности животных с обнаруженной сероконверсией в каждой из групп и анализируют данные в соответствии с моделью параллельных линий логарифмической зависимости дозы от отклика. Активность препарата определяют относительно активности препарата сравнения.

Условия достоверности. Результаты испытания являются достоверными,

если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED50 заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными животным,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности,

• границы доверительного интервала относительной активности находятся между 33% и 300% от оцененного значения активности.

Требования к активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р = 0,95) оцениваемой относительной активности должна быть не менее 1,0.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO

Выполняют иммунохимическое определение (2.7.1) содержания антигена с критериями приемлемости, валидированными в сравнении с испытанием in vivo.

Показано, что методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и радиоиммунологического анализа (РИА) с использованием моноклональных антител, специфичных к индуцирующим защитную реакцию эпитопам HBsAg являются подходящими. Используют соответствующее число разведений испытуемой вакцины и препарата сравнения. Полученные данные, которые могут быть подвергнуты преобразованию, анализируют методом параллельных линий. Наборы для оценки HBsAg in vitro являются коммерчески доступными, и возможна адаптация методов их использования для определения активности in vitro.

Критерии приемлемости для данного препарата сравнения подлежат утверждению компетентными органами с учетом данных валидации.