2.5.33. Общий белок

Многие из методов анализа, которые описаны в данном разделе, могут выполняться с использованием наборов, производимых изготовителями.

МЕТОД 1

Белок в растворе поглощает ультрафиолетовый свет при длине волны 280 нм благодаря присутствию в структуре ароматических аминокислот, главным образом тирозина и триптофана Это свойство белков может использоваться в целях их определения. Если буферный раствор, используемый для разведения белка, имеет большую оптическую плотность, относительно плотности воды, в нем присутствует интерферирующее вещество. Эту интерференцию можно устранить, если использовать буферный раствор в качестве раствора сравнения, но, если интерферирующее вещество проявляет высокую оптическую плотность, результаты могут быть подвергнуты сомнению. При низких концентрациях белок может сорбироваться на кювете, что приводит к существенному занижению концентрации его в растворе. Этого можно избежать, подготавливая образцы с высокой концентрацией или используя детергенты неионного характера.

Исследуемый раствор. Необходимое количество исследуемого вещества, растворяют в соответствующем буферном растворе для получения раствора с концентрацией белка в диапазоне от 0,2 мг/мл до 2 мг/мл.

Стандартный раствор. Готовят раствор соответствующего стандартного вещества для определяемого белка с тем же буферным раствором и в той же концентрации, как исследуемый раствор.

Методика. Во время выполнения данного исследования испытуемый раствор, стандартный раствор и раствор сравнения хранят при одинаковой температуре. Определяют оптическую плотность (2.2.25.) исследуемого раствора и стандартного раствора в кварцевой кювете при длине волны 280 нм, используя необходимый буферный раствор в качестве раствора сравнения. Результаты исследования должны быть линейными в диапазоне концентраций исследуемого белка.

Обработка полученных результатов. Точность определения белка может быть снижена за счет светорассеивания раствора исследуемого образца. Если белок в растворе существует в виде частиц, сопоставимых по размерам с длиной волны измеряемого света (250 нм - 300 нм), рассеивание светового потока приводит к очевидному увеличению оптической плотности исследуемого образца. Чтобы рассчитать оптическую плотность при длине волны 280 нм с учетом светорассеяния, определяют оптическую плотность исследуемого раствора при следующих длинах волн - 320 нм, 325 нм, 330 нм, 335 нм, 340 нм, 345 нм и 350 нм. Находят логарифмическую функцию полученной оптической плотности к длине волны и по соответствующим точкам строят график линейной регрессии. Экстраполируют данные, снятые с графика, чтобы определить логарифм оптической плотности при длине волны 280 нм. Антилогарифмом данного значения является оптическая плотность, определенная светорассеянием. Для получения оптической плотности белка в растворе корректируют наблюдаемые значения вычитанием оптической плотности, определяемой светорассеянием, из общей оптической плотности, измеренной при длине волны 280 нм. Фильтрование с использованием фильтра 0,2 мкм не поглощающего белок, или осветление центрифугированием, могут применяться для снижения эффекта светорассеяния, особенно в случае явной мутности раствора.

Расчеты. Для расчетов используют откорректированные значения. Рассчитывают концентрацию белка в исследуемом растворе (C_u), используя уравнение:

C = с ^Au As

где:

С_и - концентрация белка в исследуемом растворе; C_S - концентрация белка в стандартном растворе;

A_u и A_s - откорректированные значения оптической плотности исследуемого и стандартного раствора, соответственно.

МЕТОД 2

Данный метод (обычно называемый методом Лоури).

# Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

Развитие окраски достигает своего максимума через 20-30 мин при комнатной температуре, после чего происходит постепенное обесцвечивание. Поскольку данный метод является чувствительным к интерферирующим веществам, можно использовать процедуру для осаждения белка из исследуемой пробы. Большинство интерферирующих веществ вызывают слабое окрашивание, хотя применение некоторых детергентов может вызывать усиление цвета. Поскольку различные белки могут давать цветовые реакции различной эффективности, стандартное вещество и исследуемый белок должны быть одинаковыми. В тех случаях, когда необходимо отделение интерферирующих веществ от белка в исследуемой пробе, используют процедуру, описанную ниже для интерферирующих веществ перед тем, как подготовить исследуемый раствор. Эффект интерферирующих веществ может быть минимизирован с помощью разведения, обеспечивающего концентрацию исследуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе используют воду дистиллированную Р.

Исследуемый раствор. Достаточное количество исследуемого вещества, растворяют в указанном в частной статье буферном растворе для получения раствора с концентрацией в пределах интервала стандартного графика. При указанном буферном растворе раствор имеет рН от 10,0 до 10,5.

Стандартные растворы. Стандартное вещество, предназначенное для определения белка, растворяют в буферном растворе, используемым для приготовления исследуемого раствора. Данный раствор разводят порционно одинаковым буферным раствором, чтобы получить не менее пяти стандартных растворов с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале между 5 мкг/мл и100 мкг/мл.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления исследуемого раствора и стандартных растворов.

Реактив меди сернокислой. В дистиллированной воде Р растворяют 100 мг меди (II) сульфатаР и 0,2 г натрия тартрата Р в воде дистиллированной Р и доводят объем до 50 мл тем же растворителем. Растворяют 10 г натрия карбоната безводного Р в воде дистиллированной Р и доводят объем до 50 мл тем же растворителем. Медленно вливают раствор натрия карбоната в раствор меди сернокислой, помешивая. Раствор используют в течение 24 часов.

Реактив щелочной меди. Смешивают 1 объем реактива меди сернокислой, 2 объема 50 г/л раствора натрия додецил сульфата Р и 1 объем раствора 32 г/л натрия гидроксида Р. Хранят при комнатной температуре и используют в течение 2 недель.

Разведенный фосфомолибденовольфрамовый реактив. Смешивают 5 мл фосфомолибденовольфрамового реактива Р с 55 мл воды дистиллированной Р. Хранят в контейнере темного стекла при комнатной температуре.

Методика. К 1,0 мл каждого стандартного раствора, исследуемого раствора и контрольного раствора прибавляют 1,0 мл реактива щелочной меди и смешивают. Дают отстояться в течение 10 мин. Затем прибавляют 0,5 мл разведенного фосфомолибденовольфрамового реактива, смешивают и дают отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Определяют оптическую плотность (2.2.25) раствора при длине волны 750 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, тем не менее, если диапазон концентраций, используемый для построения стандартного графика небольшой, он близок к линейности. Строят графическую зависимость оптической плотности стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения стандартного графика. На основании стандартного графика и оптической плотности определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.

Интерферирующие субстанции. В представленной процедуре перед началом определения дезоксихолево-трихлоруксусная кислота добавляется в исследуемую пробу для удаления интерферирующих веществ. Данная методика может быть применена для концентрирования белков из разведенного раствора. Добавляют 0,1 мл раствора 1,5 г/л натрия дезоксихолата Р к 1 мл исследуемого вещества. Используя миксер, перемешивают раствор и дают отстояться при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавляют 0,1 мл раствора 720 г/л трихлоруксусной кислоты Р и перемешивают миксером. Центрифугируют при ускорении 3000 g в течение 30 мин, декантируют и удаляют остаточную жидкость пипеткой. Повторно разводят полученный осадок в 1 мл реактива щелочной меди.

МЕТОД 3

Данный метод (известный как метод Бредфорд) основан на абсорбционном сдвиге с длины волны 470 нм до 595 нм, наблюдаемом при связывании белков красителем кислотным синим 90. Краситель кислотный синий 90 связывает наиболее активно аргининовые и лизиновые остатки в белке, что может приводить к погрешности при исследовании различных белков. Белки, используемые в качестве стандартного вещества, должны быть такими же, как и белки, предназначенные для исследования. Следует избегать детергентов и амфолитов в исследуемом образце. Высоко щелочные пробы могут взаимодействовать с кислотными реагентами.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.

Исследуемый раствор. Для получения раствора с концентрацией в пределах интервала стандартного графика растворяют достаточное количество вещества, предназначенного для исследования в указанном в частной статье буферном растворе.

Стандартные растворы. Растворяют стандартное вещество, предназначенное для определения белка в том же буферном растворе, что и исследуемый раствор. Разводят порционно данный раствор этим же буферным раствором, чтобы получить не менее пяти стандартных растворов с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале между 0,1 мг/мл и 1 мг/мл.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления исследуемого раствора и растворов сравнения.

Реактив кислотный синий 90. Разводят 0,10 г реактива кислотного синего 90 Р в 50 мл спирта 96% (об/об) Р. Добавляют 100 мл кислоты фосфорной Р, доводят раствор до 1000 мл водой дистиллированной Р и перемешивают. Фильтруют раствор и хранят в контейнере темного стекла при комнатной температуре. При хранении выпадает осадок красителя, поэтому перед использованием реактив необходимо профильтровать.

Методика. Добавляют 5 мл реактива кислотного синего 90 Р к 0,100 мл каждого раствора сравнения, исследуемого и контрольного раствора. Смешивают, избегая образования пены. Определяют оптическую плотность(2.2.25.) стандартных растворов и исследуемого раствора при длине волны 595 нм, используя контрольную пробу в качестве раствора сравнения. Не используют кварцевые (кремниевые) спектрофотометрические кюветы, поскольку краситель связывается с этим материалом.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, тем не менее, если диапазон концентраций, используемый для построения стандартного графика небольшой, он близок к линейности. Строят графическую функцию оптической плотности стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения стандартного графика. На основании стандартного графика и оптической плотности определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.

МЕТОД 4

Данный метод (известный как метод бицинхонинической кислоты БХК) основывается на восстановлении белком иона двухвалентной меди (Cu²+) в ион одновалентной меди (Cu¹⁺). Реагент бицинхонинической кислоты применяется для определения иона, содержащего одновалентную медь. С реакцией интерферируют несколько веществ. Эффект интерферирующих веществ может быть минимизирован с помощью разведения, обеспечивающего концентрацию исследуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений.

Осаждение белка, описанное в Методе 2, может быть использовано для удаления интерферирующих субстанций. Поскольку различные белки могут давать цветные реакции различной интенсивности, стандартное вещество и исследуемый белок должны быть одинаковыми.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.

Исследуемый раствор. Достаточное количество вещества, предназначенного для исследования, растворяют в указанном в частной статье буферном растворе для получения раствора с концентрацией в пределах интервала стандартного графика.

Стандартные растворы. Стандартное вещество, предназначенное для определения белка, растворяют в буферном растворе, используемым при приготовлении исследуемого раствора. Данный раствор разводят порционно этим же буферным раствором, чтобы получить не менее пяти растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале между 10 мкг/мл и 1200 мкг/мл.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления тестового раствора и стандартных растворов.

БХК реактив. В воде дистиллированной Р растворяют 10 г динатрия бицинхонината Р, 20 г натрия карбоната моногидрата Р, 1,6 г натрия тартрата Р, 4 г натрия гидроксида Р, и 9,5 г натрия гидрокарбоната Р. При необходимости регулируют pH раствора до 11,25 раствором натрия гидрооксида Р_или раствором натрия гидрокарбоната Р, доводят объем до 1000 мл водой дистиллированной Р и перемешивают.

Медно-бицинхонинатовый реактив. Смешивают 1 мл раствора 40г/л меди сульфата Р и 50 мл БХК реактива.

Методика. Смешивают 0,1 мл каждого стандартного раствора, исследуемого раствора и контрольного раствора с 2 мл медно-бицинхонинатового реактива. Инкубируют раствор при температуре 37^оС в течение 30 мин. Засекают время для остывания смеси до комнатной температуры и через 60 мин после окончания инкубирования определяют оптические плотности (2.2.25) стандартных растворов и исследуемого раствора в кварцевых кюветах при длине волны 562 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Необходимо учитывать, что после остывания растворов до комнатной температуры, интенсивность цвета постепенно возрастает.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, тем не менее, если диапазон концентраций, используемый для построения стандартного графика небольшой, он близок к линейности. Строят графическую функцию оптической плотности стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения стандартного графика. На основании стандартного графика и оптической плотности определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.

МЕТОД 5

Данный метод (известный как биуретовый метод) основывается на взаимодействии иона двухвалентной меди (Cu²+) с белком в щелочной среде и образовании цветного окрашивания раствора, оптическая плотность которого измеряется при длине волны 545 нм. Данный метод демонстрирует минимальное различие между равными количествами иммуноглобулиновых и альбуминовых проб. Добавление натрия гидроксида и биуретового реактива в качестве комбинированного реагента, незначительное смешивание после добавления натрия гидроксида или значительный период времени между добавлением натрия гидроксида и добавлением биуретового реактива дает более высокие значения для иммуноглобулина по сравнению с альбуминовыми образцами. Метод трихлоруксусной кислоты, используемый для минимизации влияния интерферирующих веществ, также может использоваться для определения содержания белка в исследуемых образцах при концентрациях ниже 500 мкг/мл.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.

Исследуемый раствор. Достаточное количество исследуемого вещества, растворяют в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения раствора с концентрацией в пределах концентраций стандартных растворов.

Стандартные растворы. В растворе (9 г/л) натрия хлорида Р растворяют стандартное вещество для исследуемого белка. Пропорционально разводят этот раствор в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения не менее трех растворов сравнения с концентрацией белка, равномерно распределенной в интервале 0,5 мг/мл - 10 мг/мл.

Контрольный раствор. Используют раствор 9 г/л натрия хлорида Р.

Биуретовый реактив. Растворяют 3,46 г меди сульфата Р в 10 мл горячей воды дистиллированной и охлаждают (Раствор A). Растворяют 34,6 г натрия цитрата Р и 20,0 г натрия карбоната безводного Р в 80 мл горячей воды дистиллированной Р и охлаждают (Раствор B). Смешивают растворы А и B и доводят объем водой дистиллированной Р до 200 мл. Используют раствор в течение 6 месяцев. В случае помутнения или выпадения осадка, реактив не подлежит использованию.

Методика. К одному объему исследуемого раствора прибавляют равный объем раствора 60 г/л натрия гидроксида Р и перемешивают. Немедленно добавляют биуретовый реактив в количестве равном 0,4 объема исследуемого раствора и быстро смешивают. Выдерживают при комнатной температуре не менее 15 мин. Через 90 мин после добавления биуретового реактива определяют оптическую плотность (2.2.25) растворов сравнения и исследуемого раствора при длине волны 545 нм, используя в качестве раствора сравнения контрольный раствор. Мутные растворы или растворы с осадком не пригодны для расчета концентрации белка.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка имеет приблизительно линейный характер в рамках указанного интервала концентрации белка для стандартных растворов. Строят график зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для формирования стандартного графика. Рассчитывают коэффициент корреляции для стандартного графика. Система считается пригодной, если линейная зависимость имеет коэффициент не менее 0,99. На основании стандартного графика и оптической плотности исследуемого раствора определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.

Интерферирующие вещества. Для минимизации эффекта интерферирующих веществ белок может быть преципитирован из исследуемой пробы следующим образом: добавляют 0,1 объема раствора 500 г/л кислоты трихлоруксусной Р к 1 объему раствора исследуемого образца, удаляют всплывающий слой и разводят преципитат в небольшом объеме 0,5 М раствора натрия гидроксида Р. Используют полученный раствор для приготовления исследуемого раствора.

МЕТОД 6

Данный флюориметрический метод основан на дериватизации белка o-фталальдегидом, который в первую очередь взаимодействует с аминами белка (N-терминальная аминокислота и £-аминогруппа лизиновых остатков). Чувствительность анализа может быть повышена гидролизом белка перед добавлением о-фталальдегида. Гидролиз делает а-аминогруппу аминокислот, входящих в структуру белка, доступной для реакции с фталальдегидным реактивом.

Данный метод требует минимального содержания белка. Первичные амины как, например, трис(гидроксиметил)аминометан и аминокислотные буферные растворы взаимодействуют с фталальдегидом, вследствие чего их следует удалять. Аммоний при высоких концентрациях взаимодействует с фталальдегидом. Флюоресценция, полученная при взаимодействии амина с фталальдегидом, может быть нестабильной. Использование автоматизированных процедур для стандартизации данного метода может повысить качество и точность данного метода.

Для приготовления всех буферных растворов и реагентов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.

Исследуемый раствор. Растворяют достаточное количество исследуемого вещества, в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения раствора с концентрацией в пределах концентраций стандартных растворов. Перед добавлением фталалдегидного реактива устанавливают pH раствора от 8 до 10,5.

Стандартные растворы. Стандартное вещество исследуемого белка, растворяют в растворе 9 г/л натрия хлорида Р. Пропорционально разводят этот раствор в растворе 9 г/л натрия хлорида Р для получения не менее пяти растворов сравнения с концентрацией белка, равномерно распределенной в интервале 10 мкг/мл-200 мкг/мл. Перед добавлением фталалдегидного реактива устанавливают pH раствора от 8 до 10,5.

Контрольный раствор. Используют раствор 9 г/л натрия хлорида Р.

Боратный буферный раствор. Растворяют 61,83 г кислоты борной Р в воде дистиллированнойР и устанавливают pH 10,4 при помощи раствора калия гидроокиси Р. Доводят раствор до 1000 мл водой дистиллированной Р и перемешивают его.

Фталальдегидный основной раствор. Растворяют 1,20 г фталальдегида Р в 1,5 мл метанола Р, добавляют 100 мл боратного буферного раствора и перемешивают. Добавляют 0,6 мл раствора 300 г/л макрогол 23 лаурилового эфира Р и перемешивают. Хранят при комнатной температуре и используют в течение 3-х недель.

Фталальдегидный реактив. К 5 мл фталальдегидного основного раствора добавляют 15 мкл 2-меркаптоэтанола Р. Раствор готовят не менее, чем за 30 мин до начала использования. Хранят в течение 24 ч.

Методика. Смешивают 10 мкл исследуемого раствора и каждого из стандартных растворов с 0,1 мл фталальдегидного реактива и выдерживают при комнатной температуре 15 мин. Прибавляют 3 мл 0,5 М раствора натрия гидроксида Р и смешивают. Определяют флюоресценцию (2.2.21.) стандартных растворов и исследуемого раствора при активированной длине волны 340 нм и эмиссионной длине волны от 440 до 455 нм. Измеряют флюоресценцию данных растворов единожды, поскольку излучение снижает интенсивность флюоресценции.

Расчеты. Зависимость флюоресценции от концентрации белка имеет линейный характер. Строят график зависимости флюоресцентной интенсивности стандартных растворов от концентрации белка и используют линейную регрессию для формирования стандартного графика. На основании графика и флюоресцентной интенсивности стандартного раствора определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.

МЕТОД 7

Данный метод основывается на определении содержания азота, как способе определения белка. Интерференция, вызванная присутствием других азотсодержащих веществ в исследуемом образце, может влиять на определение белка при помощи данного метода. Техника азотного анализа основана на разрушении исследуемого образца.

Методика А. Выполняется в соответствии с описанной в частной статье процедурой для определения азота минерализацией серной кислотой (2.5.9) или при помощи прибора для определения азота по Кьельдалю.

Методика В. Анализ может выполняться при помощи приборов. Большинство приборов, применяемых для азотного анализа, используют пиролиз (сжигание образца в токе кислорода при температуре близкой к 1000^оС). При этом выделяется оксид азота (NO) и другие оксиды азота (NO_x) из азота, присутствующего в исследуемых веществах. В некоторых приборах окись азота преобразуется в азот, который измеряется теплопроводным детектором. В других приборах оксид азота (NO) смешивается с озоном (O₃), образуя при этом активированный диоксид азота (NO₂*), который испускает свет при распаде и может быть измерен хемилюминесцентным детектором. Стандартный образец белка, который относительно чист и схож по своему составу с исследуемыми белками, используется для оптимизации параметров пиролиза и оценки последовательности анализа.

Расчеты. Содержание белка рассчитывается делением содержания азота в исследуемом образце на известное содержание азота в белке. Известное содержание азота в белке можно определить на основе химического состава белка или сравнения с подходящим стандартным образцом.