2.7.6. Количественное определение вакцины дифтерии (адсорбированной)

Количественное определение вакцины дифтерии (адсорбированной) производят путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты морских свинок от эффектов либо эритрогенной дозы вводимого интрадермально токсина дифтерии, либо летальной дозы вводимого подкожно токсина дифтерии, с дозой препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующейся для получения такой же защиты.

За Международную Единицу принимают активность в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из дифтерийного анатоксина, адсорбированного на гидроксиде алюминия. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

В нижеописанном методе количественного определения используется модель параллельных линий с использованием трех разведений испытуемого и стандартного препаратов. Если аналитик обладает достаточно большим опытом работы с применением этого метода для данной вакцины, разрешается использовать упрощенную модель, включающую одно разведение для испытуемого и стандартного препаратов. Такая модель позволяет определять, обладает ли вакцина активностью, существенно превышающей необходимый минимум, но не дает информации о линейности и параллельности и кривой зависимости отклика от дозы. Упрощенная модель приводит к существенному уменьшению требуемого количества экспериментальных животных; она должна приниматься во внимание каждым аналитиком в соответствии с положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.

МЕТОД ИНТРАДЕРМАЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых белых морских свинок из одной партии размером, подходящим для предписанного количества точек введения. Разница в массе между самым тяжелым и самым легким животным не должна превышать 100 г. Морских свинок делят не менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, используют пять морских свинок в качестве невакцинированного контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного токсина. Препарат токсина дифтерии должен содержать от 67 до 133 lr/100 в 1 Lf и от 25000 до 50000 минимальных реактивных доз для кожи морских свинок в 1 Lf. Если было показано, что препарат токсина обладает стабильностью, проверка его активности перед каждым определением не является обязательной.

Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около 0,0512 Lf в 0,2 мл. Из него путем дальнейших четырехкратных разведений получают ряд из пяти растворов, содержащих около 0,0128, 0,0032, 0,0008, 0,0002 и 0,00005 Lf в 0,2 мл.

Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд не более чем с 2,5-кратным различием между последовательными разведениями, и в котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе 1,0 мл приводят в результате провокации к получению интрадермальной суммы, составляющей около 3. Каждое разведение назначают одной из групп морских свинок, каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней каждой морской свинке обривают оба бока и вводят интрадермально по 0,2 мл каждого из шести разведений токсина в шесть различных точек на коже каждой из вакцинированных морских свинок таким образом, чтобы минимизировать помехи между соседними локализациями.

Определение активности провокационного токсина. При необходимости, невакцинированным контрольным животным вводят разведения, содержащие 80, 40, 20, 10 и 5 миллионных долей Lf провокационного токсина.

Получение и интерпретация результатов. Все точки провокации контролируют через 48 часов после инъекции провокационного токсина и записывают частоту возникновения специфической дифтерийной эритемы. Записывают также количество точек, в которых такие реакции не возникли и обозначают это количество как сумму интрадермальной провокации. Суммы интрадермальной провокации для всех животных, получивших одно и то же разведение вакцины, сводят в таблицу и используют эти данные после подходящего преобразования, например, (сумма)² или агез1п((сумма/6)²) для оценки относительной активности для каждого из испытуемых препаратов методом параллельных линий.

Требования к достоверности определения. Результаты испытания являются достоверными, если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, средняя сумма, полученная для нижнего уровня дозировки, менее 3, а средняя сумма, полученная для верхнего уровня дозировки, более 3,

• в случае проведения соответствующего испытания, разведение токсина с содержанием 40 миллионных долей Lf приводит к положительной эритеме не менее чем у 80% морских свинок, а разведение с содержанием 20 миллионных долей Lf приводит к положительной эритеме менее чем у 80% морских свинок (если эти критерии не выполняются, следует выбрать другой токсин),

• границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50 до 200% от оцененного значения активности,

• при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.

МЕТОД ЛЕТАЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых морских свинок из одной партии с массой тела от 250 до 350 г. Морских свинок делят не менее, чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по пять морских свинок в качестве невакцинированного контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного токсина. Препарат токсина дифтерии должен содержать не менее 100 LD₅₀ в миллилитре. Если было показано, что препарат токсина обладает стабильностью, проверка его активности перед каждым определением не является обязательной.

Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего около 100 LD50 в миллилитре. При необходимости порции раствора провокационного токсина разбавляют тем же растворителем в соотношениях 1:32, 1:100 и 1:320.

Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе 1,0 мл защищают около 50% животных от летальных эффектов, вызываемых подкожным введением количества дифтерийного токсина, предписанного для этого испытания. Растворы каждого разведения назначают одной из групп морских свинок, каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней каждому животному вводят подкожно по 1,0 мл раствора провокационного токсина

(100 LD50).

Определение активности провокационного токсина. При необходимости, раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения назначают по одному каждой из 4 групп по 5 морских свинок и вводят подкожно по 1,0 мл каждого разведения каждой из морских свинок группы, которой это разведение было назначено.

Получение и интерпретация результатов. Через 4 дня после инъекции провокационного токсина подсчитывают число выживших морских свинок. Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции выживших животных в каждой из групп вакцинированных морских свинок.

Требования к достоверности определения. Результаты испытания являются достоверными, если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,

• в случае проведения соответствующего испытания, количество погибших животных в 4 группах по 5 морских свинок, которым был введен раствор провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD50,

• границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50 до 200% от оцененного значения активности,

• при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.