Лабораторні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
Мокротиння хворого - це суміш секрету залоз слизової оболонки трахеї і бронхів, серозного випоту з патологічно змінених судин, іноді частинок казеозних мас, некротичної грануляційної і легеневої тканини, а також домішки солей. Мокротиння виділяється при багатьох захворюваннях легень і бронхів.
У туберкульозних закладах хворі збирають мокротиння в індивідуальні контейнери, на чверть ємності заповнені розчином хлораміну, де воно частково дезінфікується. Контейнери градуйовані, і це дає змогу визначати добову кількість мокротиння.
Макроскопічно у хворих на туберкульоз легень мокротиння має слизовий або слизово - гнійний характер, без запаху, гомогенне, не утворює шарів. Кількість мокротиння може бути різною. На початку захворювання на туберкульоз легень мокротиння не виділяється, потім воно може виділятись вранці окремими плювками, пізніше його кількість може досягати 100 - 200 мл.
Після макроскопічного проводять бактеріоскопічне, бактеріологічне і біологічне дослідження мокротиння.
Бактеріоскопічний метод охоплює пряму бактеріоскопію мазків із патологічного матеріалу, забарвлених за Цілем - Нільсеном, бактеріоскопію методом флотації, люмінесцентну мікроскопію, фазовоконтрастну мікроскопію.
Бактеріоскопічне дослідження мокротиння починається з приготування мазка. Для цього мокротиння змішують з розчином натрію гідрооксиду і центрифугують для отримання осаду. Осад скляними паличками переносять на предметне скло. Другим предметним склом його рівномірно розміщують і накривають покривним скельцем. Препарат вивчають під мікроскопом. У ньому можна побачити лейкоцити, еластичні волокна (рис. 1.15), а при спеціальному забарвленні - атипові клітини і різні бактерії.
Мікобактерії забарвлюються за Грамом позитивно. Для виявлення МБТ готують мазок мокротиння, мокротиння після чого забарвлюють за Цілем - Нільсеном.
Рис. 1.15. Препарат мазку висушують його, фіксують над полум'ям спиртівки,
Завидно еластичні волокна барвлення проводиться спочатку карболовим розчином фуксину. Мікобактерії туберкульозу погано сприймають забарвлення, тому розчин фуксину наносять на препарат у великій кількості і підігрівають над полум'ям спиртівки до появи пари. Потім фарбу зливають, препарат промивають у воді і знебарвлюють у 5 % розчині сірчаної кислоти або в суміші етилового спирту з розчином соляної кислоти. При цьому всі бактерії і морфологічні елементи мокротиння, крім мікобактерій туберкульозу, знебарвлюються. Мазок промивають проточною водою, а потім наносять метиленовий синій на 1 - 2 хв. Після цього розчин фарби зливають, мазок промивають і висушують. Препарат вивчають через імерсійну систему мікроскопа, для чого на препарат наносять краплю імерсійного масла, щоб створити однакове середовище між лінзою об'єктива і препаратом. Мікобактерії туберкульозу під мікроскопом видно забарвленими у червоний колір (рис. 1.16). Метод забарвлення за Цілем - Нільсеном дає змогу виявити мікобактерії туберкульозу в тих випадках, коли в 1 см3 мокротиння міститься близько 5 000 - 10 000 МБТ за умови, якщо проглянуто 300 полів зору. При невеликій кількості МБТ в харкотинні бактеріоскопічний метод неефективний.
Дослідження мокротиння слід проводити протягом трьох днів підряд, а при негативному результаті застосувати метод флотації (від франц. floter - плавати на поверхні води або лат. fluctuo - носитись на мокротиння. хвилях).
Рис. 1.16. Препарат мазку забарвлення за Цілем - Нільсеном
Метод флотації оснований на тому, що при струшуванні двох рідин з різною питомою вагою легша рідина спливає на поверхню одночасно з мікобактеріями туберкульозу, що перебувають у суспензії. Суть методики полягає в тому, що готують водну суспензію з вуглеводородом (ксилол, бензол) і МБТ. На поверхню води спливе вершковоподібна піна з МБТ, яку відсмоктують піпеткою і наносять на предметне скло. Шар піни на предметному склі висушують і наносять новий шар піни з колби. Так нашаровують піну 5 - 6 разів, після чого мазок фіксують і забарвлюють за Цілем - Нільсеном.
Ефективнішим методом виявлення мікобактерій туберкульозу є люмінесцентна мікроскопія. Суть методу полягає в здатності мікобактерій туберкульозу, що забарвлені спеціальними барвниками (аурамін, родамін), світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є можливість проведення досліджень при менших збільшеннях мікроскопа, що забезпечує перегляд в короткий термін більшої кількості полів зору, ніж при звичайній мікроскопії. Можливість виявлення мікобактерій туберкульозу збільшується на 10 - 15 % порівняно із звичайною бактеріоскопією і на 8 % - порівняно з методом флотації.
Використовують люмінесцентний мікроскоп під малим збільшенням. На темному фоні видно золотисто - жовті мікобактерії туберкульозу.
Фазовоконтрастна мікроскопія - єдиний мікроскопічний метод дослідження, що дозволяє спостерігати мікобактерії та їх біологічно змінені форми в живому стані. Для проведення такого дослідження застосовують спеціальний фазовоконтрастний пристрій. При цитологічному дослідженні мокротиння у хворих на туберкульоз легень виявляється незначна кількість нейтрофілів у стадії значної дегенерації на фоні казе - озного детриту, скупчення мононуклеарів, гігантських клітин Пирогова - Лангханса, інколи еозинофіли.
У випадках коли мокротиння немає або воно виділяється в дуже малій кількості, хворому призначають відхаркувальну мікстуру або подразнювальні інгаляції. Крім того, у випадках, коли немає мокротиння, досліджують змив з бронхів.
Дослідження змиву з бронхів проводиться лікарем. Для цього хворому натще змазують корінь язика, задню стінку глотки і надгортанник 1 % розчином дикаїну. Потім гортанним шприцем вливають у трахею 5 - 10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У хворого зразу виникає сильний кашель і введений ізотонічний розчин натрію хлориду викашлюється на чашку Петрі. Також змив з бронхів (БАЗ - бронхоальвеолярний змив) отримують за допомогою БАЛ - бронхо - альвеолярного лаважу, який проводять під час бронхоскопії. БАЗ досліджують методом флотації або методом посіву. Дослідження змиву з бронхів дає змогу додатково виявляти МБТ у 5 - 10 % випадків.
У клінічній практиці МБТ нерідко доводиться виявляти в сечі, калі, цереброспінальній і плевральній рідині.
Дослідження сечі на МБТ проводять у тих випадках, коли під час дослідження осаду в кожному полі зору виявляється не менш як 15 лейкоцитів.
Для виявлення МБТ сечу багаторазово центрифугують, нашаровуючи кожен раз нові порції з осаду сечі на предметне скло. Мазок забарвлюють за методом Ціля - Нільсена. Виявлення мікобактерій туберкульозу в сечі свідчить про наявність туберкульозу нирок.
Для дослідження сечі за методом флотації дають їй постояти, потім 20 - 30 мл осаду обробляють, як звичайно, без підігрівання на водяній бані. Відсутність МБТ у гнійній сечі ще не виключає наявності туберкульозу нирок. У таких випадках потрібно або робити її посів на поживні середовища, або застосовувати біологічний метод дослідження.
Дослідження калу на МБТ слід проводити у випадках підозри на туберкульоз кишок. При цьому треба пам'ятати, що у хворих, які виділяють МБТ і частково заковтують мокротиння, МБТ можна виявити при дослідженні калу і за неуражених кишок, оскільки мікобактерії туберкульозу стійкі і не завжди гинуть під впливом травних соків. У калі хворих на туберкульоз кишок часто виявляється слиз, кров і домішки гною.
Виявлення МБТ у цереброспінальній рідині нерідко має вирішальне значення в діагностиці туберкульозного менінгіту. Однак бактеріоскопічним методом виявити МБТ вдається тільки у 10 - 20 % хворих на туберкульозний менінгіт.
Дослідження проводиться за такою методикою. Пробірку з цереброспінальною рідиною ставлять на 8 - 10 год. у прохолодному місці. Якщо в ній утворюється ніжна фібринна плівка (вона складається з клітин і МБТ), її наносять на предметне скло і готують препарат за методом Ціля - Нільсена. У випадках, коли плівка не утворюється, препарат готують з осаду після центрифугування.
Для виявлення МБТ у плевральному ексудаті, пунктатах і виділенні з нориць готують препарат так само, як і при дослідженні мокротиння.
Бактеріологічне дослідження складається з посіву матеріале на поживні середовища і диференціації культури МБТ від кислотостійких сапрофітів. Цим методом можна виявити мікобактерії туберкульозу тоді, коли в 1 мл матеріалу перебуває 20 - 100 мікробних клітин. Пробірки із середовищем ставлять в термостат при температурі 37 °С. Перші колонії мікобактерій можуть з'явитись на 18 - 30 - й день, а іноді - через 2 - 3 місяці. Бактеріологічне дослідження проводять одночасно з бактеріоскопічним тричі.
Посів досліджуваного матеріалу проводиться на спеціальні середовища після попередньої обробки. Найчастіше використовують такі середовища: Левенштейна - Йєнсена, Фінна - 2, Міддлбрука, Огави та ін.), які містять речовини, що затримують ріст сторонніх мікроорганізмів. Попередня обробка патологічного матеріалу полягає у знищенні супровідної бактеріальної флори. Посів матеріалу з бронхів, а також посів сечі роблять з центрифугату або осаду. При цьому сечу, якщо вона не забруднена, можна не обробляти.
Для підготовки до посіву мокротиння, плеврального ексудату, цереброспінальної рідини існує кілька методів попередньої обробки.
Метод Мазура полягає в обробці патологічного матеріалу 3 - 4 мл 2 % розчином сірчаної кислоти у стерильній пробірці. Пробірку струшують протягом 3 хв., після чого матеріал стерильною платиновою петлею наносять на яєчні середовища.
Метод Петрова: мокротиння обробляється 4 % розчином гідроксиду натрію протягом 15 хв., а потім центрифугується.
Біологічний метод - це прищеплювання патологічного матеріалу тваринам. Гвінейським свинкам або білим мишам у пахвинну ділянку або в черевну порожнину вводять досліджуваний матеріал в дозі 2 - 3 мл. Для цього його спочатку обробляють 3 - 8 % розчином соляної кислоти, добре відмивають (інакше на місці введення може виникнути некроз тканин, можлива навіть смерть тварини від дії кислоти).
Незабруднену сечу і цереброспінальну рідину можна прищеплювати без попередньої обробки. При наявності в патологічному матеріалі вірулентних штамів МБТ тварини захворюють на туберкульоз і гинуть через 1 - 2 місяці після зараження. Якщо МБТ має ослаблену вірулентність, тварина гине пізніше або може зовсім не загинути. У таких випадках тварину забивають і діагноз встановлюють після розтину, макро - і мікроскопічного виявлення туберкульозних горбків. Діагноз можна також поставити на підставі прижиттєвого дослідження збільшеного регіонарного лімфатичного вузла або інфільтрату, що виник на місці інокуляції патологічного матеріалу.
В останні роки для диференціації мікобактерій використовують метод газорідинної хроматографії, оснований на високій роздільній спроможності різних сполук (амінокислот, нуклеїнових кислот, жирів, вуглеводів і т. ін.). При цьому не виключається етап культивування збудника на поживних середовищах, що можна віднести до недоліків методу.
До прискорених методів виявлення мікобактерій належать виявлення МБТ за допомогою індикаторної пробірки BBL MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube). Ріст мікобактерій туберкульозу відбувається протягом 4 - 10 діб. Пробірки BBL MGIT містять бульйон і флуоресцентну сполуку, що реагує на кисень, розчинений у бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. При поглинанні кисню культурою МБТ спостерігається яскрава флуоресценція на дні пробірки. Такий результат вважають позитивним. Якщо флуоресценції немає або вона незначна - результат негативний. Показання пробірок враховують щодня, починаючи з другого дня інкубації.
Останнім часом для діагностики туберкульозу використовують імуноферментні та молекулярно - генетичні методи.
З 'явились методи ідентифікації МБТ за допомогою моноклональних антитіл, отриманих способом гібридомної технології. Зараз існує понад 100 моноклональних антитіл щодо епітопів основних антигенів МБТ. Застосування цих антитіл в імуноферментному аналізі дає можливість дуже швидко диференціювати вид збудника, але поки що метод використовується в наукових розробках для ідентифікації збудника туберкульозу, який найчастіше зустрічається (М. tuberculosis і М. bovis).
Серед молекулярно - генетичних методів діагностики туберкульозу найчастіше застосовується метод ДНК - зондів та полімеразно - ланцюгової реакції (ПЛР). В основі цих методів лежить принцип комплементарності нуклеотидних основ у побудові двоспіральної молекули ДНК. При проведенні ДНК - зондування у випадку наявності у пробі, що досліджується, специфічної ділянки ДНК мікобактерій утворюється гібрид (дволанцюговий фрагмент) ДНК, що досліджується, та ДНК - зонду.
В основі приципу ПЛР лежить багаторазове збільшення фрагмента ДНК. Для ампліфікації (багаторазового подвоєння гена бактерій) потрібна наявність двох праймерів (за - травок) - невеликого одноланцюгового фрагмента ДНК, що з'єднується з комплементарною ділянкою одного з ланцюгів матричної ДНК. В подальшому відбувається добудова цього ланцюга ДНК - полімеразою. Збільшення кількості (в 106 разів) фрагмента, що ампліфікується, виявляється електрофорезом в агаровому гелі. Врахування результатів реакцій здійснюється під пластинами трансілюмінатора в ультрафіолетовому світлі.
ДНК - зондування дозволяє проводити визначення мікобактерій в діагностичному матеріалі протягом 2 - 4 діб, а ПЛР - за 4 - 6 год. з максимально високою чутливістю методів - 10 - 100 - 1000 клітин у пробі, що досліджується.
Контрольні питання
Які складові частини мокротиння?
Як правильно збирати мокротиння у хворих на туберкульоз?
Які особливості мокротиння хворих на туберкульоз?
Яку кількість мокротиння виділяють хворі на туберкульоз легень?
Який матеріал можна досліджувати у хворих на туберкульоз, крім мокротиння?
Яка методика отримання змивів з бронхів?
Які є методи дослідження мокротиння на наявність МБТ?
Які бактеріоскопічні методи дослідження мокротиння підвищують можливості прямої бактеріоскопії?
Що таке метод флотації?
У чому суть люмінесцентної мікроскопії?
Як довго ростуть мікобактерії туберкульозу на поживних середовищах?
Яка оптимальна температура росту МБТ?
Які є методи прискореного виявлення мікобактерії туберкульозу?
Скільки МБТ має бути в 1 мл мокротиння для виявлення їх методом посіву?