- •Руководство
- •Раздел «морфология микроорганизмов» Тема: Виды микроскопии: назначение и принципы применения
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Светопольная микроскопия. Устройство светопольного микроскопа ипорядок работы с ним
- •Темнопольная микроскопия
- •Фазово-контрастная и аноптральная микроскопия
- •Люминесцентная микроскопия
- •Электронная микроскопия
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Подготовка предметных и покровных стекол
- •Исследование микроорганизмов в живом состоянии
- •Препараты фиксированных окрашенных клеток. Приготовление мазка и фиксация препарата
- •Окраска препаратов
- •Виды красителей
- •Методы окраски
- •Окраска фиксированных препаратов микроорганизмов
- •Окраска разведенным карболовым фуксином
- •Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии
- •Сложные или дифференциальные методы окраски микробов Дифференциально-диагностический метод окраски по Граму
- •Видоизменение окраски Грама по а. И. Синеву
- •Окраска кислото- и спиртоустойчивых микробов
- •Окраска по Цилю-Нильсену
- •Флуорохромирование аурамином
- •Модификация Шеффлера и Фултона
- •Окраска по Биттеру
- •Окраска капсул
- •Метод Бурри-Гинса
- •Способ Михина
- •Метод Леффлера
- •Серебрение по Морозову
- •Метод Грея
- •Окраска по Шенку
- •Метод Петрука
- •Окраска включений в бактериях Окраска метахроматических зерен (волютина)
- •Метод Нейссера
- •Метод Пью
- •Окраска по Мейеру
- •Флуорохромирование волютина корифосфином
- •Окраска по Раскиной
- •Окраска на грамофильную зернистость Метод Муха
- •Метод Козлова
- •Выявление клеточной стенки бактерий
- •Метод Пикарского
- •Окраска риккетсий Метод Романовского-Гимза
- •Метод Здродовского
- •Окраска хламидий
- •Метод Хайденхайна
- •Окраска йодом и йод-эозином
- •Негативная окраска по Бурри
- •Дифференциальное окрашивание мицелия
- •Окрашивание ядерного аппарата Метод Фельгена
- •Трехцветное окрашивание по Флеммингу
- •Окрашивание гематоксилином Делафильда
- •Окрашивание гематоксилином и эозином (или эритрозином)
- •Микроскопия вирусов
- •Окраска препаратов Окраска по Романовскому
- •Окраска по Муромцеву
- •Окраска по Морозову
- •Окраска по Селлеру
- •Окраска по Пигаревскому
- •Задания к лабораторному занятию
- •Раздел: “физиология микроорганизмов”
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Требования, предъявляемые к питательным средам
- •Выделение чистых культур микроорганизмов.
- •Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
- •Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах
- •Пигменты микроорганизмов
- •Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах
- •Второй этап выделения чистой культуры
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Сахаролитические ферменты микробов
- •Протеолитические ферменты микробов
- •Определение индола в культуре микроорганизмов
- •Определение сероводорода
- •Третий этап выделения чистой культуры.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Методы культивирования анаэробных микроорганизмов
- •Физические методы
- •Химический метод
- •Биологический метод
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Задания к лабораторному занятию
- •Методы санитарно-микробиологического анализа воды.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Стерилизация. Методы стерилизации.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Раздел: ”химиотерапия инфекционных заболеваний ”.
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам
- •Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом “бумажных дисков”
- •Метод двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде
- •Метод двукратных серийных разведений в плотной питательной среде
- •Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в жидких средах
- •Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в плотных средах
- •Определение чувствительности микроорганизмов к нитрофурановым препаратам методом разведений в жидких средах
- •Определение чувствительности микроорганизмов к энтеросептолу методом разведений в жидких средах
- •Ускоренные методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Раздел: "фитопатогенные микроорганизмы. Методы микробиологического контроля лекарственного сырья и готовых лекарственных средств
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Определение микробиологической чистоты лекарственного сырья и готовых лекарственных средств, не обладающих антимикробными свойствами
- •Подготовка образцов для анализа
- •Питательные среды
- •Определение общего числа бактерий
- •Определение количества плесневых и дрожжевых грибов
- •Определение присутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae
- •Определение присутствия s. Aureus и p.Aeruginosa
- •Определение микробиологической частоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием
- •Количественное определение бактерий и грибов
- •Количественное определение бактерий сем. Enterobacteriaceae (e.Coli)
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки.
- •Литература
- •Определение стерильности лекарственных средств, субстанций, вспомогательных веществ методом прямого посева
- •Определение стерильности лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ методом мембранной фильтрации
- •Задания к лабораторному занятию
- •Определение стерильности лекарственного средства
- •Раздел: « инфекция и иммунитет»
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Экспериментальная инфекция
- •Выбор и подготовка к заражению лабораторных животных
- •Методы заражения лабораторных животных
- •Вскрытие зараженных лабораторных животных
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Основы иммунодиагностики
- •Сбор иммунологического анамнеза и характеристика основных иммунопатологических синдромов
- •Диагностические тесты, проводимые непосредственно у больного (тесты in vivo)
- •Основные тесты лабораторной иммунодиагностики
- •Методы исследования лимфоцитов
- •Методы, основанные на изучении поверхностных маркеров
- •Исследование функционального состояния лимфоцитов
- •Реакция бласттрансформации лимфоцитов (рбтл)
- •Оценка интенсивности продукции цитокинов
- •Оценка гиперчувствительности замедленного типа
- •Оценка функционального состояния фагоцитов
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Реакции антиген-антитело. Химические основы
- •Определение аффинности антител
- •Основные методы выявления антител и антигенов
- •Методы, основанные на реакции преципитации
- •Двойная радиальная иммунодиффузия
- •Иммуноэлектрофорез
- •Электроиммунный анализ
- •Встречный электрофорез
- •Методы, основанные на реакции агглютинации
- •Реакция непрямой агглютинации (гемагглютинации) (рнга)
- •Реакция торможения непрямой гемагглютинации (ртнга)
- •Методы, основанные на использовании меченых реагентов
- •Радиоиммунологические методы
- •Метод иммунного окрашивания после переноса на нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблоттинг)
- •Иммуноферментные методы
- •Иммунофлуоресцентные методы
- •Применение двойной флуоресцентной метки
- •Реакция лизиса
- •Реакция связывания комплемента
- •Реакция нейтрализации
- •Феномен иммуноклеточного прилипания
- •Задания к лабораторному занятию.
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Общая характеристика, основы производства и применения бактерийных и вирусных препаратов.
- •Этапы создания искусственной вакцины
- •Аспекты gmp
- •Персонал
- •Помещения и оборудование
- •Помещения для животных и уход за ними
- •Документация
- •Производство Исходные материалы
- •Партии посевного материала и система банков клеток
- •Принципы работы
- •Контроль качества
- •Методы и условия введения препаратов
- •Методика введения гетерогенных (из крови животных) сывороток и иммуноглобулинов с предварительной внутрикожной пробой.
- •Реактогенность бактерийных и вирусных препаратов
- •Общая характеристика реактогенности
- •Оценка и учет послепрививочных реакций
- •Основные клинические формы поствакцинальных осложнении
- •Иммуномодулирующие препараты
- •Иммуностимулирующие препараты
- •Нестероидные противовоспалительные препараты (нпвп)
- •Иммунодепрессанты
- •Задания к лабораторному занятию
- •Министерство здравоохранения Украины Национальная фармацевтическая академия Украины Кафедра микробиологии
- •1 Мл содержит 1 млрд микробных тел
- •Иммунизация мышей антигеном.
Задания к лабораторному занятию.
Постановка развернутой реакции агглютинации.
Постановка реакции кольцепреципитации.
Демонстрация результатов реакции гемолиза.
Демонстрация результатов иммуноферментного анализа.
Оформление протокола занятия
Тема: Иммуномодулирующие препараты
Цель:Знать принципы технологии, применения и хранения иммунных препаратов; освоить методы приготовления убитых аутовакцин, антителообразующих гибридом; уметь определять титр сыворотки по Рамону.
Вопросы для самоподготовки
Вакцины, их назначение, виды вакцин.
Способы получения живых ослабленных вакцин. Понятие об аттенуации. Преимущества и недостатки живых вакцин. Примеры.
Способы получения убитых вакцин. Преимущества. Примеры. Понятие об аутовакцинах.
Принципы получения химических вакцин. Преимущества. Примеры.
Анатоксины: получение, примеры.
Методы генной инженерии в разработке новых вакцин. Искусственные вакцины.
Аллергены, их получение и использование.
Иммунные сыворотки, классификация, назначение.
Этапы получения антитоксических сывороток в производственных условиях (иммунизация и гипериммунизация лошадей, получение нативной сыворотки, очистка и концентрация, титрование и контроль).
Получение иммуноглобулинов.
Моноклональные антитела, применение. Использование гибридомных технологий в получении моноклональных антител.
Бактериофаги: получение, применение.
Система производства и контроля бактерийных и вирусных препаратов.
Методы и условия введения бактерийных и вирусных препаратов.
Методика введения гетерогенных (из крови животных) сывороток и иммуноглобулинов с предварительной внутрикожной пробой.
Реактогенность бактерийных и вирусных препаратов. Факторы, обусловливающие реактогенность.
Оценка и учет послепрививочных реакций. Основные клинические формы поствакцинальных осложнении.
Иммунотропные препараты: классификация, применение.
Литература
Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробиология. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 361-336.
Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 190-191.
Общая характеристика, основы производства и применения бактерийных и вирусных препаратов.
Бактерийные и вирусные препараты, применяемые в практике здравоохранения, в соответствии с целевым назначением и принципами изготовления можно разделить на следующие группы: вакцины, анатоксины, сыворотки, иммуноглобулины, моноклональные антитела, бактериофаги и аллергены.
Общей характерной особенностью всех видов бактерийных и вирусных препаратов, используемых для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний, является специфичность их действия, что отличает эти препараты от химиопрепаратов и антибиотиков.
Вакцины. Большую группу составляют наиболее широко применяемые в практике профилактические препараты, предназначенные для создания активного иммунитета против определенных инфекционных заболеваний. В нее входят различного типа вакцинные препараты. В настоящее время в практике здравоохранения с целью профилактики инфекционных заболеваний применяют следующие вакцинные препараты: 1) вакцины живые, изготовляемые на основе использования живых ослабленных, апатогенных микроорганизмов – так называемых вакцинных штаммов; 2) вакцины убитые, получаемые путем инактивации различными методами патогенных возбудителей инфекционных заболеваний; 3) вакцины химические антигены, извлекаемые из микроорганизмов различными химическими методами; 4) анатоксины, получаемые путем обезвреживания формалином токсинов, являющихся продуктом метаболизма некоторых патогенных микроорганизмов; 5) вакцины искусственные – единая синтетическая макромолекула, в которой совмещены гаптенная или слабоантигенная детерминанта с синтетической полиэлектролитной структурой.
Вакцинные, или аттенуированные, штаммы микроорганизмов получают различными методами. В некоторых случаях в качестве вакцинных штаммов, используют культуры, полученные путем отбора из числа выделяемых от больных людей и животных микроорганизмов, так называемых спонтанных мутантов, обладающих присущими вакцинным штаммам свойствами, В других случаях для получения вакцинных штаммов используют воздействие на патогенные культуры различных физических, химических и биологических факторов с последующим отбором из обработанной популяции апатогенных вариантов. Одним из главных требований, предъявляемых к вакцинным штаммам, является стойкая, наследственно закрепленная утрата ими патогенных свойств.
Живые вакцины, полученные на основе аттенуированных вакцинных штаммов микроорганизмов, обладают рядом существенных преимуществ перед вакцинами других типов – убитыми и химическими. Главными их преимуществами являются высокая напряженность, прочность и длительность обусловливаемого ими иммунитета, приближающегося к постинфекционному. Важным достоинством живых вакцин является возможность для большинства из них однократного введения. Развитие «вакцинальной инфекции», сопровождающееся размножением вакцинного штамма в организме, образованием и поступлением в организм в течение достаточно длительного времени активных антигенных субстанций, полностью обеспечивает формирование напряженного иммунитета и исключает в большинстве случаев необходимость повторных инъекций, производимых при использовании вакцин других типов.
Важным преимуществом живых вакцин перед другими видами является возможность применения не только путем подкожного введения, но и другими, более простыми путями (накожно через скарифицированную кожу, перорально, интраназально), более удобными при проведении в первую очередь массовой вакцинации.
Живые вакцины наряду с отмеченными преимуществами имеют ряд недостатков, связанных с тем, что действующим началом этих препаратов являются живые микроорганизмы.
Cтрогое соблюдение условий транспортировки, хранения и применения живых вакцин является одним из основных факторов, определяющих их эффективность в практике. Живые вакцины должны транспортироваться и храниться обязательно при температуре не выше 4-8°С. Отрицательные температуры при транспортировке и хранении не влияют на активность сухих препаратов. Совершенно недопустимо нарушение вакуума в ампулах с живыми вакцинами: попадание в ампулы воздуха и влаги приводит к инактивации препарата.
Живые вакцины не содержат консервантов, поэтому при вскрытии ампул и растворении их содержимого необходимо строго соблюдать правила асептики. В то же время следует помнить, что совершенно недопустим контакт с живыми вакцинами любых дезинфицирующих средств, инактивирующих микроорганизмы, и воздействие высокой температуры на всех этапах подготовки препарата к применению.
Учитывая особенности формирования иммунитета в ответ на введение живых вакцин, основанные на развитии «вакцинальной инфекции» очень важно в случаях применения живых бактерийных вакцин исключить за 1-2 дня до прививки и по меньшей мере на 1-й неделе после нее прием таких препаратов, как антибиотики, сульфаниламиды, иммуноглобулины, применение которых при вакцинации живыми бактерийными препаратами может резко уменьшить интенсивность «вакцинальной инфекции» и, следовательно, снизить эффект прививки. Живые вирусные вакцины можно применять одновременно с антибиотиками, так как на размножение вирусов в организме последние не влияют.
Вакцины убитые в отличие от живых представляют собой препараты, приготовленные с использованием так называемых производственных штаммов возбудителей соответствующих инфекций, обладающих полноценными антигенными свойствами и высокой вирулентностью. При изготовлении убитых вакцин специально отобранные и проверенные производственные штаммы бактерий выращивают на искусственных питательных средах (плотных или жидких), а штаммы вирусов – в организме животных или культурах тканей. Получаемые после культивирования взвеси бактерий или вирусов подвергают инактивации различными физическими и химическими методами, основными требованиями к которым являются надежность инактивации и минимальное повреждающее действие на антигены бактерий и вирусов.
В зависимости от вида микроорганизма применяют тот или иной метод инактивации, оптимальный для данного возбудителя. Полученные после инактивации взвеси микроорганизмов разводят до необходимой концентрации и затем разливают в ампулы или флаконы. Некоторые убитые вакцины готовят в сухом виде. Высушивание препаратов обеспечивает их большую стабильность, а также приводит к удалению из препаратов инактивирующих агентов (формалин, фенол) и тем самым снижает их реактогенность.
Убитые вакцины более устойчивы при хранений, чем живые. Тем не менее, чтобы исключить возможность изменения их свойств, убитые вакцины необходимо хранить при низких температурах (2-10°С). Замораживание жидких убитых вакцин недопустимо, так как при последующем оттаивании могут измениться физические свойства препарата: в нем могут появляться хлопья, происходить разрушение и лизис микробных клеток. Это приведет к повышению реактогенности вакцины за счет выхода бактерийных антигенов в жидкую фазу препарата. Хранение и транспортировка сухих препаратов при отрицательных температурах допускаются, так как не представляют для них опасности.
Эффективность убитых бактерийных и вирусных вакцин в целом ниже, чем живых. Основной способ их применения – подкожные инъекции, которые необходимо повторять из-за относительно короткого срока создаваемого убитыми вакцинами иммунитета.
Так называемые химические вакцины представляют собой наиболее активные по иммунологическим свойствам спрецифические компоненты – антигены, извлекаемые из микробных клеток физико-химическими методами. Это сложные комплексы органических соединений – полисахаридов, полипептидов, липидов. Изготовление и применение химических вакцин основано на предпосылке, что выделенные из микробной клетки иммунологически активные субстанции, освобожденные от балластных, иммунологически неактивных веществ клетки, должны быть более эффективны и менее реактогенны по сравнению с так называемыми корпускулярными вакцинами, изготовленными путем инактивации цельных микробных клеток. Это позволяет вводить человеку большие дозы антигенов, что повышает иммунологический эффект, а также создает возможность применения ассоциированных препаратов, направленных одновременно против нескольких инфекций. Кроме того, извлеченные из микробной клетки антигены более стабильны и их легче стандартизировать, чем корпускулярные вакцины.
Наряду с токсичностью, т. е. способностью вызывать патологические процессы в живом организме, токсины обладают весьма важным в практическом отношении свойством – антигенностью, т. е. способностью при введении в организм в небольших дозах вызывать образование специфических антител – антитоксинов. После добавления 0,3-0,4% формалина и выдерживания в течение нескольких дней при 37-40° Сº токсины полностью теряют токсичность, но сохраняют антигенные свойства. Полученные таким образом из токсинов препараты были названы Рамоном анатоксинами. В ряде стран такие препараты называют токсоидами.
Анатоксины, предназначенные для иммунизации людей, готовят в виде очищенных, концентрированных препаратов, адсорбированных на гидрате окиси алюминия. Необходимость очистки и концентрации первоначально полученных, так называемых нативных анатоксинов связана с тем, что изготовленные на искусственных питательных средах препараты содержат большое количество балластных веществ питательной среды, не обладающих специфической активностью и способных при введении в организм вызывать различные местные и общие реакции. Для очистки от балластных веществ нативные анатоксины подвергают специальной обработке различными химическими и физическими методами, в результате чего препараты не только освобождаются от балластных веществ, но и концентрируются по объему, что позволяет вводить необходимую дозу препарата в значительно меньшем объеме, а также осуществлять одновременную иммунизацию несколькими препаратами. Иммуногенность анатоксинов, как и ряда других вакцин, зависит не только от качества антигена, т. е. специфической активности, степени чистоты и концентрации, но и от физико-химического состояния используемого для иммунизации препарата. Адсорбция препаратов на различных минеральных адсорбентах (гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция и др.) обусловливает резкое повышение эффективности вакцинации. Это объясняется прежде всего созданием в месте инъекции адсорбированного препарата депо антигена, а также замедленным его всасыванием: дробное поступление антигена из места инъекции обеспечивает эффект суммации антигенного раздражения (по принципу физиологического закона суммации раздражения), резко повышает иммунологический эффект. Помимо этого, депонирующее вещество вызывает в месте инъекции воспалительную реакцию, которая, с одной стороны, препятствуя всасыванию антигена, усиливает депонирующее действие антигена, а с другой, являясь неспецифическим стимулятором, усиливает плазмоцитарные реакции в лимфатических тканях организма, участвующих в иммуногенезе.
Адсорбированные препараты перед употреблением необходимо взбалтывать, чтобы обеспечить равномерное распределение во всём объеме активного начала, которое перед взбалтыванием находится в осадке вместе с адсорбентом.
Искусственная вакцина представляет собой соединение специфического естественного или синтетического антигена (гаптены, белки, полисахариды) с иммунопотенциатором.
Получение исскуственных антигенов проводится в двух основных направлениях:
первое – химический синтез антигенных молекул, копирующих полностью или частично природные белковые или полисахаридные антигены бактерий, вирусов и т.д.;
второе – генно-инженерный синтез необходимых антигенов.
При конструировании искусственных вакцин наиболее перспективными являются те антигены, против которых удается стимулировать иммунный ответ вопреки природной “неотвечаемости” организма, и те, которые являются наиболее общими для разновидностей данного возбудителя, поскольку они открывают возможность создания полиспецифических вакцин, эффективных сразу против нескольких серотипов данного возбудителя.
Иммунопотенциаторы – это агенты разнообразной природы, неспецифически стимулирующие иммунный ответ к специфическим антигенам ( полисахариды бактериального и растительного происхождения; бактериальные гликопептиды; нуклеиновые кислоты; синтетические полипептиды, гликопептиды, полинуклеотиды; синтетические карбоцепные и гетероцепные полианионы и поликатионы).