Методы санитарно-микробиологического анализа воды.

Определение микробного числа водыпредполагает исследование общего количества мезофильных аэробов и факультативных анаэробов в 1мл. исследуемой воды, способных при 37 ºС в течение 24 часов образовывать на МПА колонии, видимые невооруженным глазом и при увеличении в 2-5 раз. В зависимости от степени загрязнения воды готовят последовательно ее 10-кратные разведения от 1:10 для чистых до 1:10000 для сильнозагрязненных сточных вод. При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по 1мл. неразведенной воды и заливают 10-12 мл растопленного и остуженного до 45 ºС МПА, а для выявления роста грибов – сусло-агара. Посевы на МПА выращивают в течение суток при 37 ºС, а на сусло-агаре – 2-3 суток при 27 ºС. Учет колоний производится с использованием лупы, на чашках, где выросло не более 300 колоний. Микробное число питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 100 микробных клеток в 1 мл.

Определение кишечных палочекобычно проводят с использованием метода титрации – двухэтапный бродильный метод и метода мембранных фильтров. Анализ воды проводят согласно ГОСТа 18963-73 в трех параллельных рядах, начиная с 10; 1 и 0,1 мл. Для объемов 10 мл используют флаконы по 100 мл лактозно-пептонной среды. Все остальные объемы воды вносят в пробирки с 5 мл питательной среды. На выходе в водопроводную сеть в водопроводной воде исследуют три объема по 100 мл воды, три объема по 10 мл воды и три объема по 1 мл. Для этого осуществляют посевы по 100 мл воды на концентрированную глюкозопептонную среду и по 10 мл и по 1 мл воды на разведенную среду. Культивирование посевов производят при 38ºС в течение 24 часов. В случае отсутствия помутнения среды и образования газа через сутки, дается отрицательный ответ. При наличии помутнения среды кислоты и газа из такого флакона производят посев секторами на чашки со средой Эндо, чтобы получить изолированные колонии. Если через 16-18 часов на среде выросли темно-красные с металлическим блеском или без него колонии, из них готовят мазки и проводят пробу на оксидазу. Для этого со среды Эндо снимают по 2-3 колонии каждого типа и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-n-фенилендиамином.

Наличие в мазках граммотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о положительном результате исследований, которые выражают в виде коли-индекса, т.е. количества бактерий кишечных палочек в 1 л воды. Для питьевой воды централизованного водоснабжения коли-индекс не должен быть больше трех.

При определении свежего фекального загрязненияиз трех объемов лактозо-пептонной среды, в которых после инкубации при 37ºС в течение 24 часов наблюдалось выделение газа, петлей материал высевают в лактозную среду с борной кислотой. Культивирование на элективной среде производят при 43ºС в течение суток. Наличие газа и помутнений среды указывает на свежее фекальное загрязнение воды. Если среда только помутнела без газообразования, результат не учитывается. Определение индекса фекальных кишечных палочек и бактерий группы кишечных палочек проводят по таблице 2.

Таблица 2

Определение индекса бактерий группы кишечных палочек

Количество положительных результатов анализов воды			Индекс
Из трех флаконов по 100 мл	Из трех пробирок по 10 мл	Из трех пробирок по 1 мл
0	0	0	Менее 3
0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3	0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3	1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3	3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 более 1100

Метод мембранных фильтров предполагает фильтрование воды в количествах 100, 10 и 1 мл для чистой воды и 0,1; 0,01 мл для загрязненных вод. Начинают исследования с больших разведений.

При посевах объемом 1 мл и меньше их разводят в 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем фильтруют. После окончания фильтрации изучаемого объема мембранные фильтры снимают стерильным пинцетом и помещают на поверхность среды Эндо фильтрующей поверхностью вверх. На одну чашку помещают до 3-4 мембранных фильтров. Инкубируют чашки с фильтрами при 37 ºС в течение 18-24 часов. Для учета колоний выбирают фильтры с количеством колоний от 10-50. Для расчета коли-индекса количество бактерий группы кишечных палочек, выросшие в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 и делят на этот объем. Следует отметить, что методом мембранных фильтров обычно определяется меньшее число бактерий, чем методом титрации.

Определение энтерококков

Дополнительным показателем фекального загрязнения являются энтерококки (Streptococcus faecalis и др.) индекс энтерококков в исследуемой воде определяют в параллельных рядах посевов в жидкой щелочно-полимиксиновой среде с 10-кратными разведениями в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воды от 100 до 0,01 мл. Объемы воды по 100 и 10 мл вносят в щелочную-полимиксиновую среду двойной концентрации, остальные объемы – в пробирки со средой обычной концентрации, учет производят после 24 часов инкубации при 37 ºС по изменению цвета и помутнению среды. Из этих флаконов проводят высев секторами на чашки с молочно-ингибиторной средой. Также осуществляют дополнительный учет. Фекальный стрептококк растет на секторах чашек в виде черных с металлическим блеском колоний.

Определение патогенных бактерий

Определение сальмонелл.

Посев исследуемой воды проводят в среды накопления (магниевая, селенитовая среда). Дальнейший ход исследований проводится по общепринятой для сальмонелл методике.

Определение шигелл.

Шигеллы можно определить в водопроводной воде в случае аварийных ситуаций. В качестве среды накопления при этом используют среду с охмеленным суслом (400 мл исследуемой воды вносят в флакон со 100мл охмеленного сусла). После выращивания в течение суток при 37 ºС производят высев на среду Плоскирева или Левина. Дальнейший ход исследований соответствует методам, описанным в разд. “Лабораторная диагностика бактериальной дизентерии”.

Определение энтеровирусов.

Вирусологические исследования воды производят при оценке качества водопроводной воды и определении эффективности очистки сточных вод.

Метод фильтрации

Пробу воды в количестве 1 л фильтруют через мембранный фильтр №3, предварительно доведя рH среды до 3,0 добавлением 1Н. HCl.

В качестве элюирующего раствора для снятия энтеровирусов с поверхности фильтра используют мясную воду или МПБ с рH 7,8 (добавлением 1NNaOH). В элюирующую жидкость добавляют антибиотики. После встряхивания в шюттель-аппарате в течение 30' элюат собирают в пенициллиновые флаконы, обрабатывают эфиром и хранят при - 20 ºС. Дальнейшее исследование проводят на культуре клеток.

Санитарно-бактериологический анализ воздухазакрытых помещений проводят методом оседания на чашки (седиментация) и аспирационным способом с помощью прибора Кротова.

Метод седиментации. В помещениях, где производят микробиологический анализ воздуха устанавливают открытые чашки с МПА на 10мин. Затем чашки закрывают и инкубируют в термостате при 37ºС 24 часа и при комнатной температуре 24 часа. После чего подсчитывают количество выросших колоний, измеряют диаметр чашки с целью определения ее площади. Чтобы найти количество микроорганизмов в 1м³воздуха, число выросших колоний умножают на множитель таблицы 3

Таблица 3

Диаметр чашки, см	Площадь чашки, см2	Множитель
8 9 10	50 63 78	100 80 60

Метод аспирации по Кротову

Поскольку при использовании метода седиментации могут быть определенные погрешности, связанные с тем, что оседание микроорганизмов зависит от потоков воздуха, для более точной оценки количества микрофлоры в 1м³воздуха используют аспирационный метод с помощью прибора Кротова.

С помощью центробежного вентилятора воздух всасывается через щель в крышке прибора. Щель располагается по радиусу чашки Петри, закрепленной на диске, вращающемся со скоростью около 1 оборота в секунду. В результате этого происходит равномерный посев микроорганизмов, находящихся в воздухе на поверхность питательной среды чашки Петри. Время просасывания воздуха обычно 2 мин., скорость – 20-25 метров в минуту.

Определение числа микроорганизмов в 1 м³воздуха производят по формуле:

,

гдеХ – число м/о в 1м³воздуха,

а – количество колоний выросших в течении 48 часов на чашке Петри,

в – количество воздуха пропущенного через щель прибора в л, приведенного к нормальным условиям.

Для оценки микробной чистоты воздуха, полученные данные сравниваются с данными таблицы 4.

Таблица 4

Характеристика бактериального загрязнения воздушной среды (А.И.Шафир)

Характеристика воздуха	Число м/о в 1м3воздуха
	Летний режим		Зимний режим
	Всего м/о	Зеленящего и гемолитического стрептококка	Всего м/о	Зеленящего и гемолитического стрептококка
Чистый	<1500	<16	<4500	<36
Загрязненный	>2500	>36	>7000	>124