Определение количества плесневых и дрожжевых грибов

Испытание лекарственного средства на общее число содержащихся в нем грибов проводят также методом прямого посева (см. определение общего числа бактерий). В качестве питательной среды используют среду Сабуро, инкубацию посевов осуществляют при 22,52,5С в течение 5 суток. На чашках учитывают все колонии, даже если их число менее 30.

Определение присутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae

10 г (мл) образца вносят в 100 мл среды обогащения для эктеробактерий (среда № 3), перемешивают и инкубируют при 32,52,5С в течение 24-48 ч. При наличии роста бактерий делают пересевы петлей на среду Эндо и висмут-сульфитный агар, разлитые в чашки Петри. Инкубируют при 32,52,5С в течение 24-48 часов. На среде Эндо энтеробактерии образуют крупные малинового цвета колонии с металлическим блеском (или без него), или розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 2-4мм. На висмут-сульфитном агаре вырастают черные с характерным металлическим блеском колонии или зеленоватые, коричневые. Вышеописанные колонии пересевают каждую в отдельности на скошенный в пробирках агар (среда №1) и после инкубирования при температуре 32,52,5ºС в течение 18-20 ч полученные чистые культуры пересевают на среду с феноловым красным (среда №6) для определения ферментации глюкозы (устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый) и среду с нитратом калия (среда № 7) для определения восстановления нитратов в нитриты. О наличии нитратов судят по появлению красного окрашивания после внесения в среду реактива Грисса. Параллельно ставят тест на наличие фермента цитохромоксидазы: полоску фильтровальной бумаги смачивают смесью 1% спиртового раствора нафтола – 1 и 1% раствора N-диметил-р-фенилендиамина (в соотношении 2:3) и на неё наносят чистую культуру исследуемых бактерий. О положительной оксидазной реакции судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 минут.

Если в образце обнаружены грамотрицательные, оксидазонегативные, неспорообразующие палочки, ферментирующие спустя 48 ч после посева глюкозу с образованием кислоты и газа (или только кислоты) и восстанавливающие нитраты в нитриты делают вывод о присутствии в ГЛС энтеробактерий и, следовательно, о непригодности его к использованию.

Количественное определение бактерий семейства Enterobacteriaceae, определение E. coli и Salmonella осуществляют для оценки микробиологической чистоты субстанций, вспомогательных веществ растительного, животного или другого происхождения, которые невозможно подвергнуть антимикробной обработке, и соответствующих ГЛС. При этом используется методика, описанная в дополнении № 1 Фармакопейного комитета МЗ Украины к общей статье ГФ СССР XI "Испытания на микробиологическую чистоту " от 25.12.97 г.

Определение присутствия s. Aureus и p.Aeruginosa

10 г (мл) образца ГЛС вносят в 100 мл солевого бульона (среда № 8 для накопления S. aureus P.aeruginosa), инкубируют при температуре 32,52,5ºС в течение 24-48 ч. При наличии роста бактерий делают пересевы петлей на среды № 9 (для выявления пигмента P.aeruginosa) и № 10 (солевой агар с маннитом для идентификации S. aureus).

Если после инкубирования на среде № 9 вырастают зеленоватые флуоресцирующие колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, выделяющие в среду сине-зеленый пигмент, дающие положительную цитофромоксидазную реакцию, считают, что ГЛС контаминировано синегнойной палочкой.

Если после инкубирования на среде № 10 вырастают золотисто-желтые колонки, окруженные желтыми зонами (подтверждение ферментации маннита), микроскопия которых дает грамположительные кокки, расположенные гроздьями и коагулирующие плазму, считают что ГЛС контаминировано золотистыми стафилококками.

Наличие синегнойных бактерий и золотистых стафилококков в ГЛС свидетельствует о непригодности исследуемого препарата в медицинской практике.