Иммуноферментные методы

В основу метода положена конъюгация антитела или гаптена с ферментом, которая не приводит к утрате антителом или гаптеном специфичности, а ферментом - каталитической активности. Однако в составе комплекса антиген-антитело конъюгаты гаптен-фермент или антитело-фермент теряют свою каталитическую активность.

Соединение молекул антитела с ферментом осуществляется с помощью преимущественно глутаральдегида – бифункционального реагента, взаимодействующего с Е-аминогруппами белковых молекул. В качестве фермента успешно применяют в зависимости от модификации метода либо пероксидазу, β-галактозидазу, щелочную и кислую фосфотазы (реже ацетилхолин, глюкоамилазу, глюкозооксидазу), либо лизоцим, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу и малатдегидрогеназу. Используемый для маркирования антител фермент не должен присутствовать в исследуемых, содержащих антиген клетках, так как эндогенная ферментативная активность недопустима.

Известно много вариантов постановки ИФА. Различают гомогенный и гетерогенный вариант иммуноферментного анализа. В основе гомогенного ИФА, применяемого для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), лежит ингибирование активности фермента при соединении его с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции АГ-АТ) либо, наоборот, потеря активности маркерного фермента в результате реакции АГ-АТ. Поэтому удаление свободного АГ из смеси, содержащей АГ в связанном виде, в составе иммунных комплексов невозможно. В противоположность этому при гетерогенном ИФА АГ или АТ фиксируется на твердой фазе (как правило, пластик), а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием.

В ИФА различают методы конкурентного и неконкурентного анализа.

Конкурентный метод твердофазного ИФА может быть проведен при необходимости количественного определения антигена, который может быть получен в чистом виде. Первым этапом в этом случае будет присоединение антитела к носителю за счет химической реакции или физико-химических взаимодействий. Избыток антитела удаляют отмыванием и, внося строго определенное количество меченого антигена и различие количества намеченного антигена, строят калибровочную кривую. По окончании реакции иммунные комплексы АГ-АТ оказываются присоединенными к твердой фазе за счет антитела и избыток антигена удаляют отмывкой, добавляют субстрат для фермента, останавливают реакцию по истечении определенного времени и проводят колориметрическое определение продуктов ферментативной реакции.

В другом варианте конкурентного ИФА с твердой фазой первично связывается антиген. После отмывки добавляют меченые энзимом антитела и стандартный или исследуемый антиген. Связывание меченых антител конкурентно тормозится растворенным антигеном. Количество продуктов ферментативной реакции обратно пропорционально концентрации растворенного антигена.

К числу неконкурентных методов относится метод двойных антител, или как его иногда называют, "сэндвич-метод".

Фиксированные на твердой фазе антитела инкубируют со стандартным или анализируемым антигеном. После отмывания добавляют избыток меченых антител (специфичных к этому же антигену), навязавшиеся антитела отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного антигена. Довольно часто используют немеченые вторые антитела; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых антител, специфичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые антитела должны принадлежать животным разных видов. Для иммуноферментного определения антител часто используется непрямой, неконкурентный ИФА.

Антиген фиксируют на твердой фазе, после отмывания проводят инкубацию с раствором антител. Если произошло специфическое связывание антител, их можно количественно определить при помощи меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки, ферментативной реакции.

Кроме описанных известны следующие модификации твердофазного ИФА. Вместо совместной инкубации меченых и немеченых антигенов со связанными антителами можно непосредственно инкубировать только стандартный или анализируемый антиген, а затем после отмывания проводить инкубацию с избытком энзим-меченого антигена, который взаимодействует с "незанятыми" антителами.

Кроме того, стандартный или анализируемый антиген можно инкубировать с избытком энзим-меченых антител и по окончании иммунной реакции добавлять эту смесь к антигену, фиксированному на твердой фазе. Определяют количество свободных энзим-меченых антител, связанных антигеном на твердой фазе. В обоих случаях концентрация продукта ферментативной реакции пропорциональна концентрации анализируемого антигена. Результаты учитывают фотометрически.

В настоящее время выпускается большое количество разнообразных иммуноферментных диагностических наборов как для определения антител в сыворотке или других биологических жидкостях, так и для определения антигенов. В качестве последних могут выступать возбудители различных заболеваний (вирусы коксаки В, гепатита А и В, СПИДа, простого герпеса, краснухи; бруцеллы, холерный вибрион, сальмонеллы, трепонемы, кишечная палочка), а также различные белки, определение содержания которых в крови или секретах представляет диагностический интерес (аутоантитела, факторы неспецифической защиты, гормоны, цитокины, белки острой фазы и др.).

Методика. Для проведения ИФА необходимы следующие буферные растворы.

1. Буфер присоединения – 0,05 М натриево-карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) (рН 9,5-9,7) для сорбции антигена или антител на твердый носитель. Состав буфера: 1,18 г Na₂CО₃; 3,47 г NaHCO₃; 200 мг NaNO₃. Объем буфера доводят до 1 л дистиллированной водой.

2. Буфер инкубации – фосфатно-солевой раствор (рН 7,3-7,5), который используют для разведения компонентов, вносимых в реакцию после сорбции первого компонента на носитель. Состав буфера: 17,9 г Na₂HPO₄  12 H₂O; 0,8г NaH₂PO₄2H₂O; 42,5 г NaCl ; 2,5 мл твин-20. Объем буфера доводят до 5 л дистиллированной водой, хранят при температуре 20-25 С.

3. Буфер для отмывки – изотонический раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твин-20. В качестве отмывочного буфера можно также использовать фосфатно-солевой раствор с 0,05% твин-20. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин или 5-аминосалициловая кислота.

Ортофенилендиамин готовят ex tempore следующим образом: 10 мг ортофенилендиамина, 6,1 мл 0,1 М лимонной кислоты, 6,4 мл 0,2 М Na₂HPO₄ 12H₂O (для полного растворения подогреть на водяной бане), 12,5 мл дистиллированной воды, 0,35 мл 3% Н₂О₂ .

Растворяют 80 мг 5-аминосалициловой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, доводят рН раствора до 6,0 ex tempore с помощью 1 М NaOH. Перед использованием на каждые 9 мл раствора добавляют 1 мл 0,05% Н₂О₂ .

Для проведения ИФА необходимы полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и автоматические пипетки. Для количественного учета используют спектрофотометр – регистратор экстинции при длине волны 492 нм.

Методика реакции. Первый этап ИФА – сорбция соответствующего разведения антител или антигена (в концентрации 10-20 мкг/мл) на карбонатно-бикарбонатном буфере в объеме 0,2 мл на твердую фазу в течение 1-2 ч при температуре 37С и 10-12 ч при температуре 4С. Затем отмывают лунки (для удаления несорбированного на носителе антитела или антигена) водопроводной водой, отмывочным буфером с 0,05% твин-20 в течение 5 минут (2 раза) при комнатной температуре. После этого вносят в каждую лунку по 0,2 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина на КББ и инкубируют в течение 1 ч при температуре 37С для закрытия участков поверхности лунок, оставшихся свободными после сорбции первого компонента реакции на твердый носитель. Лунку отмывают от несвязанного бычьего сывороточного альбумина и вносят исследуемый материал (антиген или антитела) по 0,2 мл в разведениях на фосфатно-солевом растворе (рН 7,2) с 0,05% твин-20. Каждое разведение материала вводят в две лунки и помещают в термостат на 1-3 ч при температуре 37С. Отмывают непрореагировавшие в иммунной реакции антигены или антитела и вносят по 0,2 мл конъюгированных антител против исследуемого антигена или антител в рабочем рахзведении на фосфатно-солевом растворе с 0,05% твин-20. Затем их инкубируют в течение 2 ч при температуре 37С. Несвязанный конъюгат отмывают с помощью буфера 3 раза по 10 минут.

В лунку вносят 0,1 мл раствора субстрата (хромогена) и выдерживают 30 минут в темноте при комнатной температуре. В процессе инкубации в присутствии пероксидазы ортофенилендиамин окрашивается в желтый цвет, а аминосалициловая кислота – в коричневый.

Для остановки реакции расщепления субстрата в лунку добавляют по 0,1 мл 1М NH₂SO₄ (или 1M NaOH).

Контроль реакции – исследуемые антиген или антитела заменяют гомологичным компонентом реакции.

Контроль конъюгата – 0,2 мл 1% бычьего сывороточного альбумина на КББ + 0,2 мл конъюгированных антител в рабочем разведении.

Результаты реакции учитывают визуально или инструментально. При визуальном учете выявляют то наибольшее разведение исследуемого материала, в котором окраска интенсивнее, чем в контроле (бычьим сывороточным альбумином). При учете результатов реакции с помощью спектрофотометра положительным считается то наибольшее разведение исследуемого материала, где уровень экстинции превышает не менее чем в 2 раза уровень экстинции соответствующего разведения гетерологичного компонента реакции.