Применение двойной флуоресцентной метки

Для одновременного анализа различных антигенов в одной и той же ткани, например, в клетках одного типа, применяют антисыворотки, меченые различными флуорохромами (ФИТЦ, ТРИТЦ).

Иммуноферритиновый (иммунно-электронно-микроскопический) метод выявления антигенов основан на применении антител, меченых ферритином. Ферритин представляет собой железосодержащий белок с молекулярной массой 750 кДа, где содержание железа может доходить до 23%. Ферритин хорошо выявляется в электронном микроскопе и поэтому используется как маркер при иммуно-электронной микроскопии.

Реакция лизиса

Реакцией лизиса называется растворение корпускулярного антигена при взаимодействии со специфическим антителом, адсорбирующим на своей поверхности комплемент. Важно подчеркнуть тот факт, что в связывании антигена и комплемента участвуют различные домены молекулы антитела: антиген связывается с N-концевыми участками тяжелых цепей, а комплимент, наоборот, - с участками, расположенными в С-концевых областях (Fс) тяжелых цепей молекул иммуноглобулинов.

Если иммуноглобулины при содействии комплемента разрушают эритроциты, из последних выходит гемоглобин и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов преобразуется в прозрачную красную жидкость, так называемую «лаковую кровь». Реакцию в данном случае называют реакцией гемолиза. Это очень чувствительная реакция, способная выявить 0,0002 мг азота белка антител в 1 мл.

Принцип гемолиза положен в основу метода локального гемолиза в геле, предложенного Н.К. Ерне и А.А. Нордин (1963) для выявления клеток, образующих антитела. В основе метода лежит контакт антигена (эритроцитов барана) в гелевой среде с лимфоидными клетками иммунизированных животных. Антитела (гемолизины) от синтезирующих их клеток диффундируют в гель и связываются с эритроцитами. Последующее добавление комплемента обуславливает лизис эритроцитов вокруг антителопродуцирующих клеток, образуя просветы (зоны гемолиза) на розовом фоне. В центре каждой зоны находится клетка, образующая антитела к эритроцитам. Сосчитав число зон, можно определить число этих клеток. Зная общее число внесенных в гель лимфоидных клеток, можно рассчитать число клеток, образующих антитела, на 10⁶ или 10⁷ клеток исследуемого органа.

Бактериолиз – лизис бактерий в результате разрушения оболочки бактериальной клетки иммуноглобулинами также при содействии также при содействии комплемента.

Методика. Иммунную сыворотку прогревают в течение 30 мин при температуре 56ºС для инактивации в ней комплемента. Взвесь микроорганизмов готовят из суточной культуры (1 млрд. микроорганизмов в 1 мл.). В первую пробирку к 0,5 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:10 (или 1:20, 1:40 и т.д.), добавляют 0,1 мл приготовленной взвеси микроорганизмов и 0,1 мл неразведенного комплемента. Во вторую пробирку – контроль инактивации комплемента в иммунной сыворотке – комплемент не добавляют. В третьей пробирке – контроль комплемента на отсутствие лизинов – иммунную сыворотку заменяют изотоническим раствором натрия хлорида.

Пробирки помещают на 2 ч в термостат при температуре 37ºС, затем делают посев петлей из каждой пробирки на чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы инкубируют в течение суток при температуре 37ºС и подсчитывают колонии.

Если в исследуемой сыворотке содержатся лизины, количество колоний на питательной среде, засеянной материалом из опытной пробирки, будет во много раз меньше, чем в чашках, содержащих материал из контрольных пробирок.

Схема проведения реакции лизиса

Ингредиент, мл	Номер пробирки
	1	2	3
Сыворотка в разведениях 1:10, 1:20 и т.д.	0,5	0,5	–
Антиген	0,1	0,1	0,1
Комплемент	0,1	–	0,1
Изотонический раствор натрия хлорида	1,3	1,4	1,8