Методы культивирования анаэробных микроорганизмов

Выращивание анаэробов более сложно, чем культивирование аэробных микроорганизмов.

Для выращивания анаэробов необходимо создать определённые условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и внешнего.

Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Для культивирования анаэробов применяют физические, химические и биологические методы.

Физические методы

Кипячение среды – наиболее простой способ удаления растворенного в ней кислорода. Для этого непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят на водяной бане в течение 10-20 мин, в результате чего из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипячённую среду быстро охлаждают под струёй холодной воды, чтобы не произошло насыщение ее кислородом воздуха. Среду засевают материалом и заливают сверху вазелиновым маслом.

Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин. Активно связываются с кислородом воздуха животные ткани паренхиматозных органов (печени, селезенки). Можно применять и ряд неорганических восстановителей: сульфиды, сероводород, цитрат титана. Редуцирующие вещества должны вводиться в концентрациях, не угнетающих рост микроорганизмов.

На свойстве животных клеток поглощать кислород основано применение сред:

Китта-Тароцци. Эта среда широко применяется для культивирования анаэробов. В её состав входят: мясо-пептониый бульон, печень животного (обычно говяжья). Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве или 0, 5 атм. -30мин.

Среду Вильсона-Блера готовят из мясо-пептонного агара к которому добавляют глюкозу, Na₂SОз, хлористое железо-- FeC1з. На этой среде анаэробные микроорганизмы, возбудители газовой анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма растут в глубине агара. При этом осуществляется восстановление сернистокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Наблюдается в пробирках и разрыв среды, свидетельствую­щий об газообразовании.

Метод Вейон-Виньяла

Заключается в том, что расплавленный в пробирке и охлаждённый до 50 ° питатель­ный агар засевают исследуемым материалом, тщательно перемешивают и натягива­ют его в пипетку Пастера. После застывания среды запаивают пипетку с обоих кон­цов или заливают концы парафином и помещают в термостат. Внутри трубки разви­ваются отдельные колонии анаэробов. Для выделения колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлёй и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

Создание вакуума в специальных аппаратах (анаэростатах)

Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате. Анаэростаты - это воздушные эксикаторы, они представляют собой металлические ци­линдрические сосуды с герметически закрывающейся крышкой. Они снабжены манометром, который показывает степень разряженности воздуха и краном для присоединения к вакуумному насосу Из анаэростата ваку­умным насосом откачивается воздух. Анаэростаты способны сохранять высокие разряжение в течение длительного времени.

Пробирки и чашки Петри с анаэробными микроорганизмами сразу после посева по­мещают в анаэростат. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.