Двойная радиальная иммунодиффузия

Принцип метода. В лунки, вырезанные в агаровом или агарозном геле, помещают антиген и антисыворотку, которые диффундируют навстречу друг другу. В том участке геля, где их соотношения эквивалентны, образуется видимый преципитат. Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод).

Методика. Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15 М NaCl) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаровый гель наносят на сторого горизонтально установленные предметные стекла, для того чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. В зависимости от характера иммунохимических исследований в агаре делают дунки при помощи готовых штампов или вырезают из стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга на расстоянии от 4 до 10 мм. В одни лунки вносят сыворотку, в другие – антигены. После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4, 20 или 37С. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 часов и в некоторых случаях может достигать 6-7 дней. По окончании иммунодиффузии можно непосредственно оценивать результаты по влажному препарату. Возможен другой способ оценки результатов. Для этого нужно сначала отмыть непреципитирующие субстанции замачиванием пластины 2-3 раза на 12 часов в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40-50С или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10В, после чего оценивают результаты иммунодиффузии.

Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.

2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с антисывороткой детерминанты антигенов неидентичны, и следовательно, сами антигены различны.

3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой «шпоры». «Шпора» часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с антигеном сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими антителами иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из антигенов имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих антител в антисыворотке приводит к образованию шпоры.

4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это означает, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической антисыворотки.

Основные типы преципитации представлены на рис. 3.

Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2-3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные.

Титрование. Для титрования растворов антигена и антисыворотки располагают лунки так, как показано на рис. 4.

Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают:

1. Расстояние от линии преципитации до центральной и периферической лунок.

2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата.

3. Интенсивность и ширину плюс преципитации.

Наибольшее разведение, при котором образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигена.

Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнивания со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена.

Простая радиальная диффузия

Принцип метода. Этот метод отличается более высокой чувствительностью, чем предыдущий, так как антисыворотка входит в состав агара, в который из лунки диффундирует антиген. По мере удаления от лунки концентрация антигена постепенно падает, пока не становится эквивалентной концентрации антител в агаре. Этот метод впервые описал Манчини в 1963 г.

Методика. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15М NaCl) на водяной бане, охлаждают до 48^оС и смешивают с АС, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35-40^оС. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем, толщиной 1 мм. На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузии проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В других случаях, пластинки с гелем отмывают 2-3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитированных белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидо черным 10В. При этом образуется хорошо различимое кольцо преципитации. Чем выше концентрация внесенного антигена, тем больше диаметр кольца. Если в реакции используется несколько стандартов с известной концентрацией антигена, то путем сравнения или постройки колибровочной кривой можно проводить количественное определение антигена в образцах.

Для определения титра антител смешивают гель в установочной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации пропорционален титру.