Задания к лабораторному занятию

1. Изучение явления фагоцитоза in vivo. Заразите белую мышь внутрибрюшинно взвесью стафилококка для изучения явления фагоцитоза in vivo. Проанализируйте защитную роль фагоцитоза в организме.

2. Определение индекса фагоцитоза. Рассчитайте индекс активности фагоцитоза по числу содержащихся в клетках бактерий в мазках, приготовленных ранее при постановке реакции фагоцитоза in vitro.

3. Демонстрация результатов метода розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана для количественной оценки содержания в крови Т-лимфоцитов.

4. Оформите протокол занятия.

Тема: Реакции антиген – антитело.

Цель: знать химические основы реакций иммунитета; освоить методики постановки реакций кольцепреципитации, развернутой реакции агглютинации.

Вопросы для самоподготовки

1. Реакции антиген-антитело. Химические основы. Аффинность – понятие. Методы определения аффинности антител.

2. Методы выявления антител и антигенов, основанные на реакции преципитации.

3. Методы выявления антител и антигенов, основанные на реакции агглютинации.

4. Методы выявления антител и антигенов, основанные на использовании меченых реагентов.

5. Методы выявления антител и антигенов, основанные на реакции лизиса.

6. Практическое использование реакций иммунитета.

Литература

1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробио­ло­гия. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 361-366.

2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руково­дство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 190-191.

Реакции антиген-антитело. Химические основы

В основе реакций иммунитета лежит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом в комплексе ( реакция антиген-антитело). В результате взаимодействия антигена с антителом происходят конформационные изменения молекулы антитела, обусловленные сближением определенных областей его молекул, возникновением новых областей или маскировкой некоторых из них.

Схематически эту реакцию можно выразить следующим образом:

АТ+АГАТ-АГ,

где АТ – свободное антитело;

АГ – свободный антиген;

АТ-АГ – комплекс антиген-антитело;

Ка – константа ассоциации;

Кд – константа диссоциации.

Пользуясь законом действующих масс, уравнение можно видоизменить:

КаАТАГ=КдАТ-АГ

и рассчитать константу равновесия:

Константа равновесия определяет аффинность – сумма сил притяжения и отталкивания между молекулами, которые возникают при взаимодействии активного центра антитела (его антигенсвязывающей области) и гомологичной антигенной детерминанты. Термин аффинность наиболее пригоден для характеристики первичного взаимодействия антигена с антителом, т.е. взаимодействия одной антигенной детерминанты с одним активным центром антитела. Однако в природе антигены и антитела поливалентны и вступают в более сложные взаимодействия, чем только первичное связывание. Поэтому энергию взаимодействия антител и поливалентных антигенов наиболее объективно характеризует функциональная аффинность, или авидность. Поскольку встречающиеся в природных условиях антигены поливалентны, очевидно, что в имунном ответе организма более важную роль играет функциональная афинность.

Поливалентное связывание антител в энергетическом отношении выгодней, чем моновалентное, поскольку оно более прочное и имеет явные функциональные и биологические преимущества – для обеспечения активного гуморального иммунитета требуются меньшие концентрации поливалентных антител, чем моновалентных.

Реакция между антителом и антигеном протекает в две стадии, первая из которых специфическая (непосредственное соединение активного центра антитела с антигенной детерминантой), вторая – неспецифическая, когда отличающийся плохой растворимостью имунный комплекс антиген-антитело выпадает в осадок. Неспецифическая стадия, как правило, осуществляется в присутствии растворов электролитов и визуально проявляется по-разному в зависимости от физического состояния антигена.

В основе иммунологической специфичности, т. е. избирательности реакции определенного антигена с соответствующим ему антителом, лежит структурная комплементарность (стерическое и химическое соответствие) антитела и антигена. Для возникновения сил притяжения эти два компонента системы должны сблизиться своими реагирующими поверхностями на расстояние не более 0,1…0,2 нм. Существенную роль в реакциях на 1-й стадии играет взаимодействие неполярных (гидрофобных) молекул с водной средой. Контакт этих молекул с молекулами воды ослабевает вследствие стремления гидрофобных групп к ассоциации. В результате возникает неполярное (гидрофобное) связывание и система антиген-антитело стабилизируется, что и приводит к появлению сил притяжения. Сила неполярных взаимодействий возрастает с температурой, так как возникновение этих взаимодействий является эндотермическим процессом.

Межмолекулярные взаимодействия антигена и антитела обусловлены также кулоновскими (ионными) силами, т.е. взаимным притяжением положительно (группа NН₃⁺) и отрицательно (группа СОО^-) заряженных токовых цепей иммуногена и стимулированного им антитела. Чем больше соответствие полярных групп реагирующих молекул, тем прочнее комплекс антиген-антитело.

Стерические силы отталкивания возникают между атомами при взаимном проникновении их электронных облаков. Чем комплементарней электронные облака, тем меньше силы отталкивания. Стерические силы отталкивания важны для сохранения прочности комплекса антиген-антитело, так как именно они определяют степень соответствия между антигенной детерминантой и активным центром антитела.

Реакция, происходящая между антителами и антигеном и начинающаяся быстрым соединением детерминантной группы антигена со специфическим активным центром антитела (1-я стадия), осложняется далее образованием длинных цепей из чередующихся молекул антигена и антител, а также разветвлением этих цепей (2-я стадия). Во второй стадии реакции происходит образование решетки антиген-антитело.

Необходимое условие образование решетки - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. На рис.1 изображены варианты соединения молекул антител с молекулами антигена. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител – связующими звеньями. В зоне избытка антител (рис.1а,б) часть антигенсвязывающих участков свободна и формирование комплекса тормозится. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, представлена на рис.1в. В зоне же избытка антигена (рис.1г,д) комплекс антиген-антитело растворяется, так как свободные и связанные в решетку молекулы антигена конкурируют между собой за двухвалентные молекулы антител, в результате чего решетка распадается на ряд растворимых комплексов типа АГ-АТ-АГ.

Окончательное формирование системы антиген-антитело протекает намного медленнее, чем 1-я стадия реакции. Это неспецифический процесс, в который могут включаться различные посторонние белки, захватывающиеся решетчатой структурой антиген-антитело и неспособные диффундировать сквозь узкие петли этой решетки в надосадочную жидкость. Скорость образования решетки зависит от температуры, ионной силы раствора и других условий. Оптимальными условиями реакции антиген-антитело in vitro считаются следующие: t=37ºС; ионная сила 0,05...0,1 и рН 6,4...8,6.