Методы, основанные на реакции агглютинации

Различают прямую и непрямую, или пассивную, агглютинацию.

В прямой агглютинации антигеном является сама микробная клетка или структурные компоненты ее поверхностной оболочки. Предел чувствительности реакции агглютинации микробов 0,01 мкг азота белка антител/мл.Количественные результаты реакции могут быть получены химическим определением содержания азота белка иммуноглобулинов.

Агглютинация определяется в большей степени особенностями клеточной оболочки и ее функциями, нежели свойствами агглютининов. Агглютинации способствует расположение антигенных рецепторов клеточной поверхности в виде скоплений. Если многовалентные агглютинины взаимодействуют одновременно с несколькими антигенными рецепторами, константа ассоциации Ка повышается по сравнению с Ка для случаев соединения антитела с антигеном единичной связью.

Ориентировочная реакция агглютинации. Ориентировочную РА проводят на предметных стеклах. Для этого на обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой несколько капель сыворотки небольших (1:10-1:20) разведений и каплю изотонического раствора натрия хлорида для контроля. В каждую каплю сыворотки, а также в каплю контроля вносят петлю суточной живой культуры микроорганизма, взятой с поверхности плотной питательной среды, или пастеровской пипеткой вводят одну каплю взвеси убитых микроорганизмов (диагностикума). Внесенную культуру тщательно перемешивают, чтобы капля жидкости была равномерно мутной.

Реакция происходит при комнатной температуре. Результаты её учитывают невооруженным глазом через 5-10 минут, иногда для этого используют лупу (х5). Если предметные стекла поместить во влажную закрытую камеру, чтобы исключить испарение капель, то результаты реакции можно учитывать и через 30-40 минут.

При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых при покачивании покровного стекла. При отрицательной – жидкость остается равномерно мутной.

В тех случаях, когда количество микроорганизмов невелико и учесть результаты реакции трудно, каплю сыворотки с внесенной в неё культурой высушивают, препарат фиксируют, окрашивают фуксином Пфейффера и микроскопируют. При положительной реакции всё поле зрения свободно от микроорганизмов, только в отдельных участках наблюдается их скопление. При отрицательной реакции микроорганизмы равномерно распределены по всему полю зрения. Эта реакция получила название микроагглютинации.

Развернутая реакция агглютинации используется для определения серогруппы, серовара микроорганизмов; проводят её по схеме, представленной в таблице. Все ингредиенты разливают по пробиркам в определенной последовательности. Сыворотку разводят 2-кратно – 1:100, 1:200, 1:400 и т.д.

Таблица

Схема проведения реакции агглютинации

Ингредиент	Номер пробирки
	1	2	3	4	5	6 Контроль антигена	7 Контроль сыворотки
Изотонический раствор натрия хлорида, мл	1	1	1	1	1	1	–
Сыворотка больного в разведении 1:50, мл	1	1	1	1	1	–	1
Полученное разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	–	1:50
Взвесь бактерий, капли	2	2	2	2	2	2	–
Инкубация при температуре 37ºС в течение 2 ч, затем при комнатной температуре 18-20ч.

В каждую пробирку с разведенной сывороткой вносят по 1-2 капли антигена (1-2 млрд. микроорганизмов в 1 мл), энергично встряхивают и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37ºС, после чего предварительно учитывают результаты реакции, начиная с контролей (сыворотки и антигена). Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взвешенных хлопьев в опытных пробирках свидетельствуют о положительной реакции. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 18-20 ч, после чего окончательно учитывают результаты. Интенсивность реакции выражается плюсами. При полной агглютинации (++++) жидкость совершенно прозрачная, а на дне пробирки осадок из хлопьев склеивающихся микроорганизмов. Чем меньше микроорганизмов агглютинировалось, тем мутнее жидкость и тем меньше хлопьевидный осадок на дне (+++, ++, +). При отрицательной реакции (–) осадка нет, взвесь остается равномерно мутной и по виду неотличима от содержимого пробирки с контролем антигена.

Применение РА для серологической диагностики инфекционных заболеваний – брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля), бруцеллеза (реакции Райта и Хаддлсона), туляремии и других заболеваний – основано на определении антител (агглютининов) в сыворотке больных.

Для проведения реакции берут у взрослого 3-5 мл крови из локтевой вены или пальца, мочки уха, а у маленьких детей 1 мл из пятки. Отделяют сыворотку крови и разводят изотоническим раствором натрия хлорида от 1:50 или 1:100 до 1:800 или 1:1600. Более низкие концентрации антител обычно не используют потому, что в крови могут находится нормальные антитела, которые способны в небольших разведениях вызывать реакцию агглютинации.

В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы – взвеси заведомо известных убитых и в отдельных случаях живых микроорганизмов. Диагностикумы из убитых организмов весьма устойчивы, не теряют своих свойств в течение нескольких лет и не представляют опасности заражения.

Техника проведения и учёт результатов РА с сывороткой больного не отличаются от таковых при развернутой реакции агглютинации для определения вида микроорганизмов.