Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Существуют различные варианты иммуноэлектрофореза. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) впервые описан Грабар и Уильямс в 1953 г. В 1955 г. Шейдеггер предложил микромодификацию этого метода, применив обычные предметные стекла.

Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков (антигенов) в забуференном геле агара; после снятия напряжения вдоль направления движения белков в электрическом поле в геле вырезают канавку, в которую вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов различных классов, идентифицируют миеломные белки. Также ИЭФ используется при диагностике иммунодефицитных состояний. Метод незаменим в последовательном наблюдении за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов.

Для разделения сложной смеси антигенов используют двухмерный (перекрестный) электрофорез. Метод включает два этапа. На первом этапе белки диффундируют под влиянием электрического поля в агарозном геле, содержащем антитела. На втором этапе пластину поворочивают на 90^о и подвергают повторный разгонке в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно охарактеризовать каждый из антигенов смеси. Этот метод, в частности, применяют для оценки степени конверсии белка системы комплемента С3 в инактивированную форму С3с в сыворотке больных СКВ или синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом.

Электроиммунный анализ

Метод впервые был предложен Лореллом в 1966 г. Гель агарозы, содержащий антисыворотку, распределяют равномерным слоем по плоской поверхности. Препарат, содержащий антиген вносят в различных разведениях в серию последовательных лунок в геле. Из лунок под воздействием постоянного электрического тока антигены мигрируют в слой агарозы, где они взаимодействуют с иммуноглобулинами. В результате этого взаимодействия образуются преципитаты АГ-АТ, приобретающие вытянутую, заостренную форму, напоминающую ракету. Отсюда другое название метода – ракетный иммуноэлектрофорез. Длина зоны преципитации при прочих равных условиях (концентрация геля, концентрация антисыворотки в геле, толщина слоя геля, режим электрофореза) находится в прямой зависимости от концентрации антигена. ЭИА используют для количественного определения белков в жидкостях организма.

Встречный электрофорез

Принцип встречного электрофореза применил в 1969 г. Бедарида для обнаружения преципитатов АГ-АТ. Иммунопреципитация происходит в слое носителя, причем в отличие от метода Ухтерлони контакт антигена с антителом происходит не вследствие свободной диффузии, а под влиянием постоянного электрического поля. Белки представляют собой амфолиты; ввиду различий аминокислотного состава они могут мигрировать в щелочной среде с разной скоростью и в разных направлениях (анодном, катодном). Если антиген и соответствующая преципитирующая антисыворотка мигрируют в разных направлениях, становится возможным их движение друг навстречу другу в слое геля или на ацетатцеллюлозной пленке. Преципитация наблюдается между стартовыми лунками обоих компонентов в течение 30-180 мин в зависимости от приложенного напряжения. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) предназаначен для обнаружения и индентификации преципитирующих систем АГ-АТ при условии, что антиген обладает электрофоретической подвижностью, отличной от той, которой обладают иммуноглобулины. ВИЭФ используют для индентификации антигенов вирусного гепатита В, антител к Aspergillus при бронхолегочном аспергилизе, антител к N.meningitidis, антител к ДНК при СКВ.