Определение аффинности антител

Для определения аффинности антител предложено много методов:

• равновесный диализ;

• модифицированный метод осаждения сульфатом аммония;

• гашение флуоресценции;

• усиление флуоресценции;

• торможение преципитации гаптеном.

Метод осаждения сульфатом аммония.

Принцип метода. Для оценки аффинности необходимо определение свободного (с) и связанного (в) гаптена. Иммуноглобулины осаждаются в мягких условиях из раствора при 33-55% насыщения сульфатом аммония без потери сродства к гаптену. Затем измеряется количество гаптена, связанного находящимися в осадке антителами и свободного гаптена в надосадочной жидкости.

Методика. Используют очищенные антитела или антисыворотку.

Очищенные антитела растворяют в нормальной сыворотке, разведенной в соотношении 1:5 или 1:10, обладающей низким сродством к соответствующему гаптену. Исследуемые антисыворотки также разводят в соотношении 1:5 или 1:10.

К 50 мкл раствора антител приливают пипеткой 50 мкл раствора гаптена.

В качестве контроля неспецифического связывания используют нормальную сыворотку в разведении 1:5 или 1:10.

В зависимости от необходимой точности определения аффинности применяют 5-20 различных концентраций гаптена, охватывающих область концентраций трех порядков (например, от 10^-5М до 10^-7М). Оба компонента тщательно перемешивают и выдерживают при 4ºС в течение 1 часа. Затем прибавляют равный объем (100 мкл) насыщенного раствора сульфата аммония при температуре 4ºС и немедленно перемешивают, чтобы избежать денатурации антител. После 30-минутной инкубации при 4ºС, в течение которой дважды проводят кратковременное встряхивание, пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 5000 об/мин при той же температуре. Надосадочную фракцию в количестве 100 мкл, в которой определяют концентрацию свободного гаптена, переносят в 10 мл сцинтиллятора. Измеряют радиоактивность образца с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Количество свободного гаптена (с) определяют непосредственно по радиоактивности материала. Количество связанного с антителами гаптена (в) вычисляют по разности между радиоактивностью надосадочной фракции раствора, содержащего специфические антитела, и раствора, содержащего нормальную сыворотку. Если концентрация антител известна то, в может быть преобразовано в молярное соотношение Г/АТ.

Метод равновесного диализа

Принцип метода.Раствор антител известной концентрации приводится в соприкосновение с раствором гаптена через полупроницаемую мембрану. Оба компонента растворены в одинаковом буфере для того, чтобы исключить разницу рН и ионной силы. Молекулы антител не проходят через мембрану, молекулы гаптена диффундируют через нее в раствор антител и частично связываются с ними. Состояние равновесия достигается, когда концентрация свободного гаптена становится одинаковой по обе стороны мембраны. Время диффузии зависит от проницаемости мембраны, природы гаптена и температуры. Измерив концентрацию свободного гаптена по обе стороны мембраны, можно определить количество гаптена, связанного с антителами.