Оценка интенсивности продукции цитокинов

С помощью тестов этой группы можно получить представление о продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. Следует иметь в виду, что одни цитокины продуцируются преимущественно лимфоцитами (ИЛ-2, ИЛ-6), а другие – моноцитами (ИЛ-1, TNF); продукцию первых стимулируют Т-клеточные митогены (ФГА, Кон А), продукцию вторых – микробные липополисахариды (ЛПС).

Исследование проводят по следующей схеме. Мононуклеары периферической крови, выделенные методом градиентного центрифугирования, культивируют в 24-луночных культуральных планшетах (объем лунки около 2 мл) в течение 16-18 ч в присутствии Кон А, ФГА или ЛПС. Надосадочную жидкость собирают и опреде­ляют в ней содержание цитокина. Для определения содержания цитокинов исполь­зуют либо иммуноферментный анализ, либо цитокинзависимые клеточные линии. Принцип определения основан на том, что клеточная линия способна размножаться только в присутствии определенного цитокина. Интенсивность пролиферации кле­ток линии в присутствии разных разведений исследуемого образца сравнивают с интенсивностью пролиферации клеток той же линии в присутствии различных разведений рекомбинантного цитокина с известной активностью. Математическое сравнение полученных титровочных кривых позволяет вычислить содержание цитокина в исследуемом образце. В некоторых случаях используют не цитокинзависимую, а цитокинчувствительную клеточную линию. Клетки этой линии гибнут в присутствии цитокина. Таким образом, титровочная кривая будет отражать процент погибших клеток, которых будет тем больше, чем выше концентрация цитокина.

Определение специфических IgE обычно проводят с помощью кожных проб. Определение специфических IgE с помощью радиоаллергосорбентного теста показано при высоком риске анафилактических реакций, поражении кожи. Суть метода заключается в следующем:

1. к аллергену, сорбированному на твердой подложке, добавляют исследуемую сыворотку;

2. после отмывания несвязавшихся IgE добавляют меченые антитела к IgE;

3. по уровню радиоактивности оценивают содержание специфических IgE в исследуемой пробе.

Применяется модификация метода с использованием меченных ферментом антител к IgE.

Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками. Суть методов заключается в следующем:

1. к тучным клеткам, покрытым специфическими IgE, добавляют антиген;

2. связывание антигена с IgE вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение гистамина;

3. определяют содержание гистамина в растворе.

Эти методы могут использоваться для изучения влияния лекарственных средств и других веществ на тучные клетки и базофилы при аллергических заболеваниях. Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками, трудоемки и применяются редко.

Оценка гиперчувствительности замедленного типа

Для оценки гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) используют реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), которая по своей сути является пробирочным аналогом клеточных иммунных реакций ГЗТ. В качестве веществ, модулирующих (тормозящих или активирующих) спонтанную миграционную активность лейкоцитов, применяют те же митогены, что и при РБТЛ. Кроме того, могут быть использованы тканевые и микробные антигены, стандартные аллергены. Последние применяют при диагностике саркоидоза, туберкулеза, альвеолитов и других заболеваний, протекающих с образованием эпителиоидноклеточных гранулемм (тканевое выражение ГЗТ).

Анализируемые клетки помещают в стеклянные капилляры, которые инкубируют в чашках Петри с культуральной средой с добавлением или без добавления (спонтанный уровень миграции) митогена либо антигена. Сравнение интенсивности миграции в опытной и контрольной чашках позволяет вычислить индекс миграции.