Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам

Среды для определения чувствительности должны отвечать следующим требованиям:

1. быть стандартными и обеспечивать оптимальные условия роста микроорганизмов;

2. не содержать ингибиторов бактериального роста и чрезмерного количества стимуляторов;

3. не содержать веществ, подавляющих действия антибактериальных химиопрепаратов.

Взятие проб. Материал для посева из горла, ран, язв следует брать стерильным ватным тампоном. Экссудат из полостей (плевры, брюшной полости, суставов, абсцессов) набирают стерильным шприцем. Кровь из вен желательно брать в период пика температурной кривой. При взятии проб мочи следует соблюдать условии асептики. В исследовании используют осадок, полученный при центрифугировании мочи.

Выделение чистых культур и идентификация микробов производится по правилам бактериологической техники.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом “бумажных дисков”

Этот метод является наиболее простым, быстрым, доступным и широко используемым, его проводят, прежде всего, для оценки эффективности антибиотиков в клинических условиях. Он является качественным методом, позволяющим установить лишь факт чувствительности или устойчивости возбудителя инфекции к данному антибиотику.

Определение чувствительности проводят с чистыми культурами бактерий, однако, в ряде случаев с целью быстрого получения ориентированных данных о чувствительности микроорганизмов для исследования используют непосредственно патологический материал.

Питательную среду разливают в чашки Петри, помещённые на строго горизонтальной поверхности, заполнив их на одинаковую высоту 4 мм (25 мл среды для чашек с внутренним диаметром 9 см). Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог легко всасываться.

Взятый тампоном материал для исследования помещают в стерильную пробирку, в которую добавляют 1,5 мл физиологического раствора или бульона, встряхивают для получения смыва. Клинический материал или культуру микроорганизма, выделенную от больного, засевают на поверхность застывшего агара в чашку Петри, равномерно распределяют путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Чашки подсушивают в течение 30-40 мин. при комнатной температуре.

После впитывания жидкости в агар на него прокаленным пинцетом накладывают диски, слегка придавливая, на равномерном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку помещают 6 дисков.

Диски представляют собой небольшие кружки диаметром 6 мм, сделанные из специального картона, пропитанные определённым количеством разных антибиотиков. Содержание антибиотиков в диске, указанное на этикетке, соответствует рекомендациям ВОЗ.

После наложения дисков чашки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Чашки помещают в термостат на 18-24 часа при температуре 37 ºС в перевернутом кверху дном положении, после чего учитывают результаты.

Если испытуемая микробная флора чувствительна к одному из антибиотиков, вокруг соответственного диска образуется зона задержки роста и тем большая, чем сильнее действие антибиотика. Измеряют диаметры зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самих дисков, с помощью линейки или измерителя с точностью до 1 мм.

Единичные колонии или тонкая плёнка роста внутри зоны задержки роста не учитываются. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска свидетельствует о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм, штамм расценивается как малочувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику.

В ответе должно быть написано, какой чувствительностью обладает исследуемая культура, а не размер зоны задержки роста.

Для терапии данной инфекции рекомендуют те антибиотики, вокруг дисков, которых получены наибольшие зоны задержки роста.

Определение чувствительности бактерий к антибактериальным химиопрепаратам методом диффузии в агар

Подбирают одинакового размера чашки Петри, устанавливают их на горизонтальную поверхность (отрегулированную по ватерпасу), наливают 10 мл незараженного “голодного” агара. После застывания этого слоя на него помещают стерильные цилиндры из стекла или нержавеющей стали (высота 10 мм, внутренний диаметр 6 мм) и заливают их “зараженным” агаром в количестве 15 мл. Для этого растопленный и охлажденный агар добавляют к агаровому смыву суточной культуры или к смыву, полученному из патологического материала. Густоту взвеси определяют по стандарту мутности № 5 с последующим разведением до нужного количества микробных клеток в 1 мл.

По застывании второго слоя агара цилиндры вынимают и в образовавшиеся лунки вносят испытуемые химиопрепараты антибактериального действия. В каждую лунку помещают 0,3 + (-) 0,05 мл исследуемого препарата. Мазевые формы вносят в лунку до полного ее заполнения. В одной чашке Петри можно испытать активность шести образцов различных препаратов.

Посевы термостатируют при t 37 º C в течение 24-48 часов, затем учитывают результаты. Измеряют зоны задержки роста тест-микроба, отчетливо видных вокруг лунок. Высокочувствительными к данному антибиотику считают микроорганизмы, дающие при его действии зоны задержки роста, превышающие 25 мм, чувствительными - 15-25 мм, малочувствительными – 11-15 мм.

Оценка результатов аналогична приведенной в описании метода “бумажных дисков”.

Метод последовательных разведений антибактериальных химиопрепаратов в питательной среде является более надежным и точным количественным методом

Установление степени чувствительности к ряду антибактериальных препаратов микроба, вызывающего инфекционный процесс, влияет на выбор химиопрепарата (отказ от препаратов, характеризующихся относительно высокой токсичностью при умеренной чувствительности к ним возбудителя), его дозировку (концентрация антибиотика в крови в 2-3 раза должна превышать его МПК в отношении возбудителя) и режим введения.

Существуют две модификации метода определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам на жидкой и на плотных питательных средах. Метод дает возможность определить минимальную подавляющую рост концентрацию препарата (МПК) для выделенного штамма возбудителя. Он заключается в приготовлении ряда последовательных разведений антибактериального химиопрепарата в питательной среде с внесением во все разведения исследуемой культуры. По подавлению роста микроба определённой концентрацией препарата в питательной среде судят о степени чувствительности микроорганизма. Ряд разведений химиопрепарата в жидкой питательной среде служит для определения чувствительности данного штамма. На чашке Петри с плотной питательной средой можно определить чувствительность большого числа штаммов (20 и более при посеве штрихом или с помощью штампа-репликатора).

Метод серийных разведений в плотной питательной среде даёт возможность определить чувствительность к антибактериальным химиопрепаратам отдельных вариантов штамма. При использовании жидкой среды выявляется чувствительность штамма в целом.

При определении чувствительности методом серийных разведений необходимо выделение возбудителя в чистой культуре.

Различают бактерицидное (убивающее микробы) и бактериостатическое (задерживающее рост микробов) действие препаратов. В отношении противогрибковых препаратов говорят о фунгицидной (фунгистатической) активности.