Исследование функционального состояния лимфоцитов

Существует большое число методов, позволяющих исследовать in vitro различ­ные функции лимфоидных клеток. В частности, в клинических иммунологических лабораториях исследуют интенсивность пролиферативного ответа лимфоцитов на Т- и В-клеточные митогены, продукцию антител, а также синтез мононуклеарами пе­риферической крови цитокинов.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (рбтл)

Известны вещества, оказывающие на лимфоциты млекопитающих митогенное действие (табл. 1).

Таблица 1

Неспецифические митогены лимфоцитов

Митоген	Происхождение	Мишень
ФГА	Phaseolus vuldaris	Т-лимфоциты
Кон А	Canavalia ensitormis	Т-лимфоциты
Митоген лаконоса МЛ (PWM)	Phytolacca americana	В-лимфоциты в при­сутствии Т-клеток
ЛПС	грамположительные бактерии	В-лимфоциты

Чаще для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов в клинической лабораторной практике используют фитогемагглютинин (ФГА) – растительный лек­тин, получаемый из семян фасоли. Обычно мононуклеарные лейкоциты, выделен­ные из периферической крови методом градиентного центрифугирования, культи­вируют в присутствии ФГА в течение 72 ч. Результаты реакции можно учитывать либо морфологическим методом, либо по включению радиоактивной метки.

В первом случае из клеточной культуры готовят мазки, фиксируют их в мета­ноле и окрашивают по Романовскому-Гимза, так же, как мазки крови. В световом микроскопе с иммерсионной системой определяют процент бластов по отношению к общему количеству лимфоцитов. Результат может быть выражен также в виде ин­декса стимуляции (ИС), представляющего собой отношение процента трансформи­рованных клеток в опыте (культура с ФГА) к проценту трансформированных клеток в контроле (культура без ФГА).

Учет результатов по включению радиоактивной метки более удобен. Этот ме­тод позволяет уменьшить количество крови для исследования, а также сократить расход питательных сред и трудозатраты. Культивирование проводят не в пробир­ках или флаконах, а в 96-луночных планшетах с объемом лунки около 200 мкл. В каждую лунку достаточно внести 50000 клеток, что в пересчете на цельную кровь составляет 0,05 мл. За 4-6 ч до окончания культивирования в лунки вносят зН-ти­мидин. Далее с помощью специального прибора (клеточного харвестера) клетки пе­реносят на стеклянные фильтры, избыток метки смывают большим количеством воды, фильтры высушивают и помещают во флаконы со сцинтилляционной жид­костью. Уровень включения метки оценивают на сцинтилляционном спектрофото­метре. Результаты выражают в импульсах в минуту или в виде индекса стимуляции (отношение уровня включения метки в культуре с ФГА к уровню включения метки клетками, культивировавшимися без ФГА).

На интенсивность стимуляции лимфоцитов могут влиять условия культивиро­вания, качество использованных реактивов, качество сыворотки, используемой в ка­честве добавки к питательной среде.

При оценке результатов РБТЛ следует обращать внимание, как на интенсив­ность пролиферативного ответа стимулированной культуры, так и на высоту ответа в контрольных лунках. Снижение пролиферативного ответа на ФГА свидетельст­вует о наличии иммунодефицита, однако механизмы последнего могут быть раз­личны.