Окраска кислото- и спиртоустойчивых микробов

В связи с высоким содержанием липидов эта группа бактерий плохо прокрашивается обычными растворами анилиновых красителей, поэтому для их окраски используют либо концентрированные красители при условии прогревания мазка, либо флуорохромы. В последнем случае для изучения препарата используют люминесцентную микроскопию.

Окраска по Цилю-Нильсену

Наиболее употребительный метод окраски микобактерий ту­беркулеза. Для увеличения степени проницаемости бактериальной клетки препарат окрашивают фуксином Циля при подогревании. Окрашенные кислотоустойчивые микроорганизмы затем не обес­цвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спир­тами.

Техника.

1. Фиксированный мазок покрывают фильтроваль­ной бумагой и наливают фуксин Циля. Затем, удер­живая препарат пинцетом, подогревают его в пламени горелки до отхождения паров. Повторяют манипуляцию 2-3 раза, добав­ляя по мере необходимости краску. После охлаждения снимают бумагу и промывают водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, затем тщательно промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового си­него в течение 3-5 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Мазок, окра­шенный по Цилю-Нильсену, вместо докраски метиленовым синим можно протравливать насыщенным раствором пикриновой кислоты (по Шпенглеру).

Микроскопическая картина. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в розово-красный цвет, другие формы приобре­тают синюю окраску (рис.15).

Флуорохромирование аурамином

Техника. Фиксированный препарат окрашивают смесью аурамина 00 (0,12 г), карболовой кислоты (5 мл), дистиллированной воды (до 100 мл). Краситель нали­вают на мазок, подогревают на пламени до появления паров. Через 10 мин препарат промывают водой и обесцвечивают 15 с солянокислым спиртом. Препарат промывают и подсушивают на воздухе.

Микроскопическая картина. Туберкулезные микобактерии флуоресцируют золотисто-желтым цветом.

Окраска акридиновым оранжевым

Техника. Мазки, фиксированные 3-5 мин метиловым спиртом, погружают в раствор (1:10000) краси­теля, к 10 мл которого добавлено 3-5 капель 10% раствора ам­миака. Через 24 ч препарат обесцвечивают 3% солянокислым спиртом (дважды по 10 с), промывают и высушивают.

Микроскопическая картина. Туберкулезные микобактерии флуоресцируют желто-оранжевым цветом.

Флуорохромирование акридиновым желтым

Техника. Мазок на 30 с помещают в водный раствор (1:5000) флуорохрома, затем про­мывают. Дифференцируют солянокислым спиртом 15 с, вновь про­мывают и высушивают.

Микроскопическая картина. Туберкулезные микобактерии флуоресцируют желтым цветом.

Окраска спор

Бактериальные споры, отличающиеся от вегетативных клеток многослойной липидосодержащей оболочкой, пропитанной депиколатом кальция, не поддаются окраске простыми методами и по Граму. Для окраски спор разработаны специальные методы, направленные на увеличение их проницаемости с использованием растворов кислот, концентрированных красителей и подогрева.

Способ Пешкова

Техника. На мазок, фиксированный жаром (над пламе­нем!), наливают синий Леффлера и подогревают стекло до заки­пания краски. Дают 15-20 с покипеть, а затем (после того как стекло остынет!) промывают водой и докрашивают препарат 30 с 0,5% водным раствором нейтрального красного. Вновь промы­вают, сушат и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Споры окрашиваются в голу­бой цвет, клетки – в розовый.

Способ Ганзена

Техника. Препарат, приготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1-2 мин карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2% рас­твор азотной кислоты в спирте или в 1 % водный раствор сер­ной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докра­шивают водным раствором метиленового синего.

Микроскопическая картина. Споры окрашиваются в крас­ный цвет.

Метод Ожешки

Техника. На нефиксированный мазок наливают 0,5% рас­твор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2 мин. С препарата сливают кислоту, промывают его водой и после высы­хания фиксируют на пламени. Фиксированный препарат красят по способу Циля-Нильсена.

Микроскопическая картина. Тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры – в красный (рис.16).

Метод Виртца в модификации Саватеева

Приготовление растворов. К насыщенному водному рас­твору (около 5%) малахитового зеленого добавляют 5% глице­рина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и вы­сушивают их (лучше при 50С). Затем готовят 0,5% водный рас­твор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтро­вальной бумаги и высушивают.

Техника. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2-3 капли дистиллированной воды и накладывают по­лоску фильтровальной бумаги, окрашенной малахитовым зеленым. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров (3-4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении воды ее добавляют. После остывания препарата краску с бумаж­кой смывают струей воды (полминуты) и сейчас же на мокрую поверхность препараты кладут бумажку, окрашенную сафранином. Через 30-40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Свободно лежащие споры – зе­леновато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток – темно-зеленые, вегетативные формы микробов – красные.