Иммунофлуоресцентные методы

В основу флуоресцентного метода положено такое взаимодействие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции обладает способностью к вторичной флуоресценции благодаря предварительному ковалентному соединению с флуоресцентным красителем. Образовавшиеся таким образом иммунные комплексы становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами на темном фоне под флуоресцентным микроскопом. В качестве флуоресцентных красителей используют флуоресценизотиоцианат, родамин, В-изотиоционат, мессамин-родамин В200-сульфохлорид и др., имеющие реакционноспособные группы (сульфохлорид, изотиоцианат и др.). Эти группы соединяют со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромами специфического сродства к соответствующему антигену.

Известны различные варианты постановки иммунофлуоресцентного анализа.

Прямая РИФ – предполагает применение иммунофлуоресцирующих сывороток против каждого изучаемого антигена.

Непрямая РИФ – основана на использовании двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченные антитела против изучаемого антигена, а на втором этапе реакции образовавшийся комплекс антиген-антитело обрабатывают меченной антисывороткой, содержащей антитела против гамма-глобулинов того вида животных, на которых были получены антисыворотки, использованные на первом этапе реакции (антивидовая сыворотка).

Антикомплементарная РИФ – предполагает применение меченых антител против комплемента. Используется в тех случаях, когда комплекс антиген-антитело способен фиксировать комплемент. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет выявлять антиген по специфическому свечению в люминисцентном микроскопе.

Достоинством непрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или, соответственно, антикомплементарной) при изучении различных антигенов, что значительно упрощает реакцию.

РИФ может быть использована для изучения различных микробных антигенов в препаратах из материала больных, срезов тканей, инфицированных культур клеток и др., а также для определения количества антител в иммунной сыворотке. Важнейшей областью применения непрямого иммунофлуоресцентного анализа является обнаружение аутоантител в сыворотках пациентов с аутоиммунными заболеваниями.

Методика. Исследуемый материал помещают на стекло и фиксируют в ацетоне 10 мин при комнатной температуре, после чего высушивают в течение 20 мин при температуре 37ºС. Дальнейшая обработка препаратов зависит от применяемого варианта РИФ.

При прямой РИФ препарат окрашивают специфической меченой антисывороткой во влажной камере 30 мин при температуре 25ºС, после чего промывают буферным солевым раствором (рН 7,2) 10 мин при температуре 25ºС.

При непрямой РИФ препарат вначале обрабатывают немеченой специфической антисывороткой во влажной камере 30 мин при температуре 25ºС, после чего промывают буферным солевым раствором (рН 7,2) 10 мин при температуре 25ºС. Далее препарат окрашивают антивидовой меченой сывороткой во влажной камере 30 мин при температуре 25ºС и промывают буферным солевым раствором (рН 7,2).

При антикомплементарной РИФ препарат вначале обрабатывают немеченой специфической антисывороткой и комплементом морской свинки (1:10) во влажной камере в течение 30 мин при температуре 25ºС, после чего промывают и окрашивают антикомплементарной (против глобулинов морской свинки) меченой сывороткой во влажной камере 30 мин при температуре 25ºС и промывают буферным солевым раствором (рН 7,2).

Приготовленные препараты высушивают с помощью фильтровальной бумаги и изучают в люминесцентном микроскопе – сначала при помощи сухого объектива (40), а затем, поместив на препарат каплю нефлуоресцирующего масла, с помощью иммерсионного объектива (90). При этом обращают внимание не только на наличие зеленого или зелено-желтого свечения, но и его интенсивность, характер распределения свечения в изучаемой клетке.

Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей, среди которых особое значение имеет контроль с гетерологичным антигеном. Для исключения аутофлуоресценции и неспецифического связывания меченых антител с поверхностью клеток при изучении инфицированных культур клеток обязательно используют контроль с нормальной, неинфицированной культурой. Для подавления аутофлуоресценции препаратов можно использовать бычий альбумин, меченый сульфародамином.