- •Руководство
- •Раздел «морфология микроорганизмов» Тема: Виды микроскопии: назначение и принципы применения
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Светопольная микроскопия. Устройство светопольного микроскопа ипорядок работы с ним
- •Темнопольная микроскопия
- •Фазово-контрастная и аноптральная микроскопия
- •Люминесцентная микроскопия
- •Электронная микроскопия
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Подготовка предметных и покровных стекол
- •Исследование микроорганизмов в живом состоянии
- •Препараты фиксированных окрашенных клеток. Приготовление мазка и фиксация препарата
- •Окраска препаратов
- •Виды красителей
- •Методы окраски
- •Окраска фиксированных препаратов микроорганизмов
- •Окраска разведенным карболовым фуксином
- •Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии
- •Сложные или дифференциальные методы окраски микробов Дифференциально-диагностический метод окраски по Граму
- •Видоизменение окраски Грама по а. И. Синеву
- •Окраска кислото- и спиртоустойчивых микробов
- •Окраска по Цилю-Нильсену
- •Флуорохромирование аурамином
- •Модификация Шеффлера и Фултона
- •Окраска по Биттеру
- •Окраска капсул
- •Метод Бурри-Гинса
- •Способ Михина
- •Метод Леффлера
- •Серебрение по Морозову
- •Метод Грея
- •Окраска по Шенку
- •Метод Петрука
- •Окраска включений в бактериях Окраска метахроматических зерен (волютина)
- •Метод Нейссера
- •Метод Пью
- •Окраска по Мейеру
- •Флуорохромирование волютина корифосфином
- •Окраска по Раскиной
- •Окраска на грамофильную зернистость Метод Муха
- •Метод Козлова
- •Выявление клеточной стенки бактерий
- •Метод Пикарского
- •Окраска риккетсий Метод Романовского-Гимза
- •Метод Здродовского
- •Окраска хламидий
- •Метод Хайденхайна
- •Окраска йодом и йод-эозином
- •Негативная окраска по Бурри
- •Дифференциальное окрашивание мицелия
- •Окрашивание ядерного аппарата Метод Фельгена
- •Трехцветное окрашивание по Флеммингу
- •Окрашивание гематоксилином Делафильда
- •Окрашивание гематоксилином и эозином (или эритрозином)
- •Микроскопия вирусов
- •Окраска препаратов Окраска по Романовскому
- •Окраска по Муромцеву
- •Окраска по Морозову
- •Окраска по Селлеру
- •Окраска по Пигаревскому
- •Задания к лабораторному занятию
- •Раздел: “физиология микроорганизмов”
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Требования, предъявляемые к питательным средам
- •Выделение чистых культур микроорганизмов.
- •Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
- •Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах
- •Пигменты микроорганизмов
- •Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах
- •Второй этап выделения чистой культуры
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Сахаролитические ферменты микробов
- •Протеолитические ферменты микробов
- •Определение индола в культуре микроорганизмов
- •Определение сероводорода
- •Третий этап выделения чистой культуры.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Методы культивирования анаэробных микроорганизмов
- •Физические методы
- •Химический метод
- •Биологический метод
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Задания к лабораторному занятию
- •Методы санитарно-микробиологического анализа воды.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Стерилизация. Методы стерилизации.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Раздел: ”химиотерапия инфекционных заболеваний ”.
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам
- •Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом “бумажных дисков”
- •Метод двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде
- •Метод двукратных серийных разведений в плотной питательной среде
- •Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в жидких средах
- •Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в плотных средах
- •Определение чувствительности микроорганизмов к нитрофурановым препаратам методом разведений в жидких средах
- •Определение чувствительности микроорганизмов к энтеросептолу методом разведений в жидких средах
- •Ускоренные методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.
- •Задания к лабораторному занятию
- •Раздел: "фитопатогенные микроорганизмы. Методы микробиологического контроля лекарственного сырья и готовых лекарственных средств
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Определение микробиологической чистоты лекарственного сырья и готовых лекарственных средств, не обладающих антимикробными свойствами
- •Подготовка образцов для анализа
- •Питательные среды
- •Определение общего числа бактерий
- •Определение количества плесневых и дрожжевых грибов
- •Определение присутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae
- •Определение присутствия s. Aureus и p.Aeruginosa
- •Определение микробиологической частоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием
- •Количественное определение бактерий и грибов
- •Количественное определение бактерий сем. Enterobacteriaceae (e.Coli)
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки.
- •Литература
- •Определение стерильности лекарственных средств, субстанций, вспомогательных веществ методом прямого посева
- •Определение стерильности лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ методом мембранной фильтрации
- •Задания к лабораторному занятию
- •Определение стерильности лекарственного средства
- •Раздел: « инфекция и иммунитет»
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Экспериментальная инфекция
- •Выбор и подготовка к заражению лабораторных животных
- •Методы заражения лабораторных животных
- •Вскрытие зараженных лабораторных животных
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Основы иммунодиагностики
- •Сбор иммунологического анамнеза и характеристика основных иммунопатологических синдромов
- •Диагностические тесты, проводимые непосредственно у больного (тесты in vivo)
- •Основные тесты лабораторной иммунодиагностики
- •Методы исследования лимфоцитов
- •Методы, основанные на изучении поверхностных маркеров
- •Исследование функционального состояния лимфоцитов
- •Реакция бласттрансформации лимфоцитов (рбтл)
- •Оценка интенсивности продукции цитокинов
- •Оценка гиперчувствительности замедленного типа
- •Оценка функционального состояния фагоцитов
- •Задания к лабораторному занятию
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Реакции антиген-антитело. Химические основы
- •Определение аффинности антител
- •Основные методы выявления антител и антигенов
- •Методы, основанные на реакции преципитации
- •Двойная радиальная иммунодиффузия
- •Иммуноэлектрофорез
- •Электроиммунный анализ
- •Встречный электрофорез
- •Методы, основанные на реакции агглютинации
- •Реакция непрямой агглютинации (гемагглютинации) (рнга)
- •Реакция торможения непрямой гемагглютинации (ртнга)
- •Методы, основанные на использовании меченых реагентов
- •Радиоиммунологические методы
- •Метод иммунного окрашивания после переноса на нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблоттинг)
- •Иммуноферментные методы
- •Иммунофлуоресцентные методы
- •Применение двойной флуоресцентной метки
- •Реакция лизиса
- •Реакция связывания комплемента
- •Реакция нейтрализации
- •Феномен иммуноклеточного прилипания
- •Задания к лабораторному занятию.
- •Вопросы для самоподготовки
- •Литература
- •Общая характеристика, основы производства и применения бактерийных и вирусных препаратов.
- •Этапы создания искусственной вакцины
- •Аспекты gmp
- •Персонал
- •Помещения и оборудование
- •Помещения для животных и уход за ними
- •Документация
- •Производство Исходные материалы
- •Партии посевного материала и система банков клеток
- •Принципы работы
- •Контроль качества
- •Методы и условия введения препаратов
- •Методика введения гетерогенных (из крови животных) сывороток и иммуноглобулинов с предварительной внутрикожной пробой.
- •Реактогенность бактерийных и вирусных препаратов
- •Общая характеристика реактогенности
- •Оценка и учет послепрививочных реакций
- •Основные клинические формы поствакцинальных осложнении
- •Иммуномодулирующие препараты
- •Иммуностимулирующие препараты
- •Нестероидные противовоспалительные препараты (нпвп)
- •Иммунодепрессанты
- •Задания к лабораторному занятию
- •Министерство здравоохранения Украины Национальная фармацевтическая академия Украины Кафедра микробиологии
- •1 Мл содержит 1 млрд микробных тел
- •Иммунизация мышей антигеном.
Задания к лабораторному занятию
Произвести заражение на хорионаллантоисную оболочку куриного эмбриона вирусом осповакцины.
Провести заражение в аллантоисную полость куриного эмбриона вирус
содержащим материалом.
Освоить технику вскрытия куриного эмбриона.
Определить репродукцию вируса в курином эмбрионе и клеточной культуре по ЦПД вируса.
РАЗДЕЛ "ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ"
Тема: Распространение микроорганизмов в природе
Цель: Изучение методов санитарно-бактериологического исследования почвы, воды, воздуха
Вопросы для самоподготовки
Микрофлора почвы.
Микрофлора воды.
Микрофлора воздуха.
Санитарно-микробиологический анализ почвы.
Санитарно-микробиологический анализ воды.
Санитарно-микробиологический анализ воздуха.
Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах окружающей среды.
Литература
Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробиология. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 143-147.
Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 74-84.
В природе микроорганизмы распространены везде, где они находят условия для роста и размножения. При отсутствии таких условий, микроорганизмы могут лишь временно сохранять свою жизнеспособность. Наиболее благоприятные для жизнедеятельности микробов условия имеются в почве, богатой органическими веществами. Наибольшее количество микроорганизмов наблюдается на глубине 5-15 см от её поверхности. В почве обитают грибы, водоросли, бактерии, фаги, простейшие. Микроорганизмы почвы играют большую роль в круговороте веществ в природе. Почва является основным резервуаром микроорганизмов в природе. Из неё микроорганизмы могут попадать в воду, воздух, на листья растений, лекарственного растительного сырья и т. д. В прибрежных и поверхностных водах открытых водоёмов содержится также большое количество микроорганизмов. Водоёмы, располагающиеся возле крупных городов, а также животноводческих ферм, как правило, богаты микроорганизмами в результате их загрязнения канализационными и сточными водами.
Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов. Поэтому большинство микроорганизмов могут находиться в нём лишь некоторое время.
Патогенные микроорганизмы, обитающие в организме больных или носителей попадая в почву и воду с выделениями (моча, кал), в воздух при разговоре, кашле, чихании могут сохраняться там, в течение определённого времени. В этом случае окружающая среда становится фактором передачи патогенных микробов.
Санитарно-микробиологические исследования почвы проводят с целью определения ее санитарно-гигиенического состояния, а также для эпидемиологических исследований, выявления путей заражения и сроков выживаемости патогенных микроорганизмов, загрязнения грунтовой воды и открытых водоёмов.
Санитарно-микробиологические исследования воды проводят с целью санитарного контроля и по эпидемиологическим показаниям на наличие патогенных кишечных бактерий (сальмонелл, шигелл), энтеровирусов и показателей свежего фекального загрязнения.
Санитарно-микробиологические исследования воздуха проводят с целью определения биологического показателя загрязнения его микрофлорой носоглотки человека, а также непосредственного обнаружения патогенных стафилококков, синегнойных палочек, других грамотрицательных условно-патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций. На предприятиях микробиологической промышленности изучается содержание в воздухе микроорганизмов-продуцентов. Например, на ферментных заводах – грибов рода Aspergillus и споровых бактерий.
Точное количественное определение бактерий в почве, воде, воздухе затруднено в связи с тем, что невозможно создать условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, которые отличаются между собой по типам дыхания, питания. Поэтому большое значение для санитарно-микробиологической оценки внешней среды имеют санитарно-показательные микроорганизмы, которыми являются представители нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных. Эти микроорганизмы легко поддаются обнаружению и определению количественными методами и служат показателем загрязнения окружающей среды выделениями человека.
Для почвы санитарно-показательными микроорганизмами являются кишечная палочка – E. coli, Streptococcus faecalis, Clostridium perfrigens. Для воды санитарно-показательными микроорганизмами выбраны – E.coli, Streptococcus faecalis; для воздуха – Streptococcus haemolyticus, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus.
Методы санитарно-микробиологического анализа почвы включают количественный учет сапрофитных бактерий, по которому судят о микробном числе почвы; определение количества бактерий группы кишечных палочек методами титрации, мембранных фильтров, методом прямого поверхносного посева; определение Cl. perfringens, сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка и ботулизма.
При учете численности микроорганизмов почвы применяют диспергирование в воде находящихся в почве бактерий. В асептических условиях, пробы почвы измельчают, растирают в ступке и готовят для чистых почв до 3-4 десятикратных разведений в стерильной водопроводной воде. При определении микробного числа почвы(это количество микроорганизмов, содержащиеся в 1г. почвы) должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений, в зависимости от предполагаемого загрязнения исследуемой почвы.
Перед посевом каждое разведение в пробирках перемешивают стерильной пипеткой, затем из него отбирают 1мл. и переносят на дно стерильной чашки Петри. Каждое разведение вносят не менее чем на 2 чашки, в которые затем вливают 7-10мл. растопленного и остуженного до 45С МПА или сусло-агара. Расплавленный агар перемешивают с имеющейся взвесью почвы с помощью покачивания чашки. Отмечают разведение пробы и инкубируют при температуре 28-30 ºС в течение 24 часов. Для удобства подсчета следует брать те разведения при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. В качестве примера можно привести следующую схему заполнения протокола.
Таблица1
Наименование участка |
Количество подсчитанных бактерий в разведениях 1:10000 |
Число бактерий в 1г почвы (Микробное число) |
Двор аптечного учреждения |
70 среднее 80 90 |
800000 |
Микробное число почвы показывает общую численность в основном сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА или сусло-агаре. Для определения коли-титра почвы(наименьшее количество исследуемого материала в граммах, в котором обнаруживается жизнеспособная E. coli) используют элективные питательные среды, содержащие желчь и другие компоненты, тормозящие рост большинства микробов, населяющих почву, кроме кишечной палочки.
Метод титрациипредполагает засев первоначального разведения почвенной суспензии 1:10 во флаконы с 50мл. жидких сред, что соответствует 1г. почвы.
Чаще всего используют посев почвы в лактозный бульон с 1,5мл и 2% водного раствора ТТХ (2-3,5трифенилтетразолия хлорида). Кишечная палочка способна восстанавливать ТТХ бесцветное соединение в трифенолформазан, выпадающий в виде осадка придающего среде красно-коричневый цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, который тормозит рост большинства микробов. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37ºС. При наличии в среде ТТХ газообразования и изменения цвета среды на кирпично-красный производят посев на среду Эндо или розоловый агар. При наличии на среде Эндо розовых или красных колоний грам-отрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью осуществляют их подсчет. Для подтверждения их ферментативной способности делают посев выросших колоний на полужидкую среду с глюкозой, затем на 24 ч. помещают при температуре 37С. В случае появления в среде кислоты и газа исследование на наличие кишечных палочек считается положительным. Результат анализа выражают коли-титром.
Можно использовать другой метод посева соответствующих разведений почвенной суспензии – на среду Кеслера-Свенертона с последующей экспозицией в течение 24-48 ч. при температуре 37 ºС. После чего в случае газообразования и помутнения на среде Кеслера-Свенертона так же производят высев на среду Эндо или розоловый агар. Дальнейший ход исследований полностью совпадает с выше-описанным.
Метод мембранных фильтров
Этот метод позволяет сократить время анализа на двое суток благодаря исключению этапа накопления микроорганизмов на жидких средах. При анализе почвы в небольших разведениях (1:10; 1:100), чтобы избежать накопления на фильтрах накопления почвенных частиц, мешающих выявлению кишечной палочки при выращивании на фильтре, на мембранный фильтр накладывают предварительный планктонный фильтр. Подсчет колоний осуществляют на тех фильтрах, где из соответствующего разведения выросло не более 30-50 колоний. Затем осуществляют пересчет выращенных на фильтрах колоний на 1г. почвы.
Метод прямого поверхностного посеваприменяют при анализе загрязненных почв. Для этого среду Эндо разливают в чашки Петри, подсушивают в сушильном шкафу. Готовят почвенную суспензию, как указанно ваше, используя разведение до 1:1000000. Посевы выращивают при температуре 37 ºС в течение 24 часов. Затем производят подсчет розовых и красных колоний с металлическим блеском. Для более точного определения соответствующие бактерии должны быть изучены по схеме, которая применяется при исследовании воды. При необходимости перевода коли-индекса в титр кишечной палочки необходимо 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс.
Определение Clostridium perfringens
Готовят почвенные разведения до 1:100000, которые переносят по 1мл. в два ряда пробирок. Один ряд прогревают в течение 15 мин. при 80 ºС или 10 мин. при 90 ºС. Затем во все пробирки вносят по 10 мл. расплавленной и охлажденной до 45 ºС среды Вильсона-Блер и вращением пробирки между ладонями равномерно распределяют почвенную суспензию и быстро опускают в холодную воду для быстрого охлаждения и удаления воздуха из среды. Учет колоний можно начинать через 2 часа экспозиции при 43 ºС. В глубине агара вырастают черные колонии, разрывающие среду в следствии газообразования. В приготовленных из этих колоний мазках Cl.рerfringens определяются в виде характерных грам-положительных палочек.
Другой метод определения Cl. рerfringens в почве производится с использованием сульфит-полимиксиннеомициновой среды (СПН). Инкубация посевов проводится при 44-45 ºС в течение 10-12 часов. Дальнейшая идентификация выросших колоний не требуется.
Определение сальмонелл и шигелл.
Метод коагуляции и центрифугирования по Фикеру. Для исследования берут 30-50 г почвы. Посевы почвы производят из основного разведения 1:10 в стерильной водопроводной воде. С целью концентрации сальмонелл к 500 мл взвеси почвенной суспензии добавляют 2 мл 10% стерильного раствора бикарбоната натрия, а затем 1,7 мл 10% стерильного раствора сульфата окиси железа – (Fe2SO4)3. После размешивания суспензию оставляют на 1 час при 4 ºС. Образовавшиеся после коагуляции хлопья вместе с частицами почвы и бактериями оседают на дно. Осадок центрифугируют 5мин. и растворяют в 25% стерильном растворе виннокаменнокислого калия, прибавляя его по каплям до растворения осадка. После чего осадок высевают по 0,5-1мл на плотные элективные среды Вильсона-Блер и Плоскирева с помощью стерильного шпателя. Этим же шпателем заражают еще 3-4 чашки. Оставшийся осадок заливают 50мл. 10-20 % желчного бульона, при 37 ºС инкубируют 5-6 часов и производят ранний высев петлей на плотные элективные среды, а через 8-20 часов дополнительный высев. Дальнейшая идентификация сальмонелл и шигелл производится по общепринятой методике.
Применение магниевой среды “М” для обнаружения сальмонелл в почве.
В подготовленную суспензию почвы вносят растворы и навески магниевой среды в отношении 1:1. Посевы инкубируют при 37 ºС. Через 18-20 часов производят высев петлей на 3-5 чашек висмутсульфитного агара. Дополнительная идентификация проводится по общепринятой методике.
Концентрацию микробов при исследовании в ней шигелл и сальмонелл можно проводить с помощью мембранных фильтров. После того как пропустили определенное количество почвенной суспензии, каждый мембранный фильтр накладывают на чашку с дифференциальной средой и размазывают шпателем осадок с фильтра по всей чашке. Посевы выращивают при 37 ºС.
Исследование почвы на наличие Clostridium tetani
Пробы почвы 20-30 г. собирают в стерильную посуду, затем растирают в стерильной ступке 3-5 г, разводят 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. После отстаивания в течение 3-4 часов при комнатной температуре полученную взвесь вносят в количестве 1 мл белым мышам подкожно в правую заднюю конечность. Каждую пробу испытывают на двух мышах. В качестве контроля берут мышей, которым до введения почвенной взвеси было введена противостолбнячная сыворотка. Гибель первой группы мышей с характерными симптомами и выживание контрольных животных указывает на наличие Cl. tetani в почве.
Определение Clostridium bоtulinum в почвепроизводят растирая в стерильной фарфоровой ступке 20-30 г почвы, затем переносят в колбу с 80-100 мл среды Китта-Тароцци. Одну из колб при этом прогревают до 80 ºС в течение 30 мин. для уничтожения неспорообразующих микроорганизмов. Прогретую и непрогретую колбы ставят в термостат при температуре 37 ºС на 8-14 дней, после чего из среды обогащения проводят посев в агар столбиком или на чашки с сахарным агаром с дальнейшим изучением биологических и антигенных свойств полученных культур по методам, описанным для клостридий.