Методы, основанные на использовании меченых реагентов
В настоящее время разработано много методов, предусматривающих применение меченых антител и антигенов. Чаще с этой целью используют радиоактивную или ферментную метку.
Радиоиммунологические методы
В радиоиммунологическом анализе специфичность реакции антиген-антитело сочетается с высокой чквствительностью, обеспечиваемой применением радиоактивной метки. В качестве метки чаще применяют радионуклиды йода (131J или 125J). Возможность проводить конкурентный анализ, а также анализ в жидкой или твердой фазе приводит к созданию большого числа различных методик.
Для определения антигенов используют классический радиоиммунологический анализ (РИА). В основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого немеченого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител. При этом происходит вытеснение меченого антигена из его комплекса с антителом вследствие последующего добавления больших концентраций немеченого антигена или гаптена той же специфичности. Реакция (при высоком разведении ингредиентов) подчиняется закону действующих масс: вытеснение меченого антигена пропорционально введенному количеству немеченого антигена или гаптена. Конкуренцию между определяемым и меченым антигенами можно оценить количественно с помощью радиометрии, предварительно определив образовавшиеся иммунные комплексы от несвязавшегося меченого антигена. Концентрацию определяемого антигена рассчитывают, исходя из сравнения соотношений свободного и связанного меченых реагентов с соответствующим стандартом.
Применяют также так называемые твердофазные методы. В качестве твердофазного носителя используют поверхности планшетов с лунками, бус, пленками из полистирола или других полимерных синтетических материалов. Адсорбированные (иммобилизированные) антигены и антитела длительное время сохраняют способность вступать в серологические реакции. Существуют различные модификации проведения твердофазного РИА: конкурентный метод, обратный метод, непрямой метод.
РИА используют для определения антигенов вирусов гепатита, СПИДа, в лабораторной диагностике легионеллеза, дифтерии и других инфекций. Этот метод весьма эффективен при диагностике аллергии. Аллерген, иммобилизованный на сорбенте, инкубируют с сывороткой больного, после чего добавляют радиоактивно меченые анти-JgE-антитела.
Метод иммунного окрашивания после переноса на нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблоттинг)
Этот метод применяется для количественного определения белков и гликопротеинов, которые после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле переносят на микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Неспецифически связанные с мембраной антигены обрабатывают специфическими антителами, связывание которых проявляют антиглобулиновыми антителами, конъюгированными с радиоактивной или ферментной меткой.
Схема последовательных этапов иммуноблоттинга
|
|
Фракционируют антигены путем электрофореза в ПААГ с ДСН |
|
|
|
Переносят антигены на нитроцеллюлозную микропористую мембрану |
|
|
|
Инкубируют мембрану с блокирующим реагентом для насыщения неспецифически связывающих групп |
|
|
|
Инкубируют мембрану со специфическими антителами |
|
|
|
Инкубируют с антиглобулиновым реагентом |
| ||||
|
| ||||||
|
J125-меченым |
|
биотированным |
|
Конъюгированным с ферментом
| ||
|
Выявляют антиген методом авторадиографии |
|
Инкубируют со смесью авидина и биотированного фермента |
|
Выявляют антиген, добавляя субстрат; при расщеплении субстрата образуются окрашенные продукты |
Методика.
Лоскут нитроцеллюлозной мембраны, соответствующий по размерам пластинке геля, смачивают, погрузив целиком в буфер на 20 мин.
Приготовленный к блоттингу гель также погружают в буфер для насыщения на 20 минут.
На пористую прокладку накладывают 1-2 смоченных буфером листа фильтровальной бумаги.
Сверху на фильтровальную бумагу помещают пластинку геля
На гель накладывают нитроцеллюлозную мембрану, тщательно следя за тем, чтобы между гелем и мембраной не образовались пузырьки воздуха.
Поверх мембраны накладывают два листа фильтровальной бумаги и завершают приготовление «сэндвича» еще одной пористой прокладкой.
Кассету с «сэндвичем» погружают в камеру для блоттинга, наполненную буфером. При переносе из геля, содержащего ДСН, в буфере с рН 8,3 молекулы белков имеют отрицательный заряд и движутся к положительно заряженному аноду. Поэтому необходимо проследить, чтобы мембрана прилегала к гелю именно со стороны анода.
Закончив перенос, «сэндвич» раскладывают, отделяя гель и мембрану друг от друга.
Окрашивают гель кислотным (кумасси) ярко-синим, чтобы определить насколько полно прошел перенос белков.
Для выявления белков; перенесенных на мембрану, последнюю окрашивают 0,55% раствором амидочерного в смеси метанол-уксусная кислота-вода (1:5:1) в течение 3 мин. Затем отмывают в воде и обесцвечивают смесью ментол-уксусная кислота-вода (9:2:100).
Прежде чем инкубировать мембрану с препаратами специфических антител, необходимо заблокировать все ее участки неспецифической адсорбции белка. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют на качалке в течении 2 ч. при комнатной температуре в буфере, содержащем блокирующий раствор. Для удаления избытка постороннего белка мембрану дважды ополаскивают в буфере.
Антитела растворяют в буфере.
Полоски мембраны помещают между двумя листками термоплавкой пленки и запаивают с трех сторон. Наполняют сделанный таким образом чехол раствором антител, удаляют пузырьки воздуха и запаивают сверху.
Полоски мембраны инкубируют в растворе антител в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После инкубации полоски мембраны в течение 15-30 мин промывают в 3-5 сменах буферного раствора.
После отмывания полоски мембраны инкубируют в растворе биотинированных антител в течение 1 часа при комнатной температуре. Если используем антиглобулины, меченые 125J, инкубацию рекомендуется продлить до 6-16 часов.
Полоски мембраны отмывают так же, как после инкубации с первыми антителами. Если вторые антитела были помечены 125J, то полоски мембраны после отмывания высушивают. Высушенную мембрану помещают на фильтровальную бумагу, накрывают рентгеновской пленкой и экспонируют.
Для выявления антигенов, связавших через первые антитела вторые биотинированные антитела, полоски мембраны инкубируют с биотинированным ферментом (пероксидаза хрена) в присутствии авидина или стрептавидина, через молекулы которых фермент присоединяется к антителам. Инкубируют в течение 1 часа при 4оС.
После инкубации полоски мембраны дважды отмывают в буфере.
На полоски мембраны наносят раствор диаминобензидина с 0,33% Н2О2.
Цветная реакция развивается в пределах 1-15 мин после добавления субстрата. Для остановки реакции полоски мембраны дважды отмывают в дистиллированной воде и высушивают.
Полоски мембраны следует защищать от света, иначе возможно их выцветание.