Задания к лабораторному занятию

1. Бактериоскопическое исследование микроорганизмов зубного налета.

2. Количественное бактериологическое исследование смывов с рук.

Тема: Генетика микроорганизмов

Цель: Изучить методы обнаружения мутаций и генетических рекомбинаций у бактерий, возможности применения генетических методов для создания лекарственныx средств.

Вопросы для самоподготовки

1. Виды изменчивости y микоорганизмов.

2. Примеры фенотипической изменчивости.

3. Примеры генотипической изменчивости.

4. Назвать виды мyтаций.

5. В чем суть явления генетической рекомбинации?

6. Дать понятие трансформации.

7. Определить понятие трансдукции.

8. Понятие о конъюгации.

9. Использование методов генной инженерии для создания микроорганизмов – продyцентов лекарственных средств.

Литература

1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробио­ло­гия. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 68-76.

2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руково­дство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 59-62.

Микроорганизмы, главным образом, бактерии, являются оптимальной моделью для генетическиx исследований по целомy рядy причин:

• Во-первых, формирование на питательныx средаx в течение сyток большого количества бактериальныx попyляций позволяет проводить быстрый количественный и качественный yчет иx изменений.

• Во-вторых, гаплоидный набор генов прокариотов исключает y ниx явление доминантности, что обеспечивает быстрое выявление мyтировавшиx генов.

• В-третьих простота постановки экспериментов по селективномy анализy микробной попyляции и выделение особей, мyтировавшиx с частотой 10^–9 и выше обеспечивает эффективность работы.

Постановка флюктуационного теста Лурия и Дельбрюка для выявления частоты спонтанных мутаций, возникающих в бактериальной популяции без предварительного воздействия какого-либо мутагена. Чтобы определить частоту стрептомицинустойчивых спонтантных мутантов в культуре кишечной палочки, чувствительной к стрептомицину, её засевают одновременно в одну пробирку с 10 мл МПБ и в 10 пробирок с 1 мл той же среды по 100-1000 клеток. После инкубации посевов при 37 ºС в течение 24 часов из каждой пробы делают высевы в чашки Петри с МПБ, содержащем 10 ЕД. стрептомицина. Пробы из первой пробирки (с 10 мл МПБ ) в количестве 0,1 мл засевают на 10 чашек и на отдельные чашки в том же объеме 0,1 мл из каждой пробирки на отдельную чашку. Общее число посевов таким образом составляет 20 чашек, которые впоследствии инкубируют в течение 18-20 часов (рис. 1).

В случае роста на агаровой среде со стретомицином стрептомицинрезистентных бактерий, образовавшихся только в течение суточного контакта с антибиотиком, число колоний на всех чашках должно быть примерно одинаковым. Образование на чашках различного числа колоний, выросших при высеве из отдельных пробирок в исследуемой популяции бактерий, свидетельствует о наличии в ней стрептомицинрезистентных мутантных клеток (Str^r).Значительные колебания (флюктуации) количества мутантных клеток обусловлены различным временем возникновения мутаций. Культура, в которой мутация произошла ещё до высева на чашки, будет содержать большее число стрептомицинрезистентных клеток и наоборот. Такие флюктуации могут проявиться только при высеве из отдельной пробирки на свою чашку. При высеве из общей пробирки мутанты независимо от момента их возникновения будут равномерно распределены по всей популяции бульонной культуры.

Постановка опытов трансформации.

В качестве реципиента используют культуру стрептомицинчувствительных сенных палочек Bacillus subtilis. Донором является ДНК, выделенная из стрептомицинрезистентного штамма сенной палочки. Селективной средой для отбора трансформантов служит агар, содержащий 100 ЕД стрептомицина.

Для осуществления трансформации к 1 мл бульонной культуры сенной палочки добавляют 1 мкг./ мл ДНК донора и инкубируют при 37С в течение 30 минут. После этого на 5 минут в пробирку вносят 0,1 мг/ мл раствора фермента ДНК-азы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиента. Затем 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Чтобы определить количество клеток реципиентной культуры, готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10^–5-10^-6 и высевают в объёме 0,1 мл на агар без стрептомицина. При этом контролем служит посев на агар со стрептомицином, на котором чувствительная культура не должна расти. После инкубации при 37 С в течение 24 часов определяют частоту трансформации по отношению числа выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Например, если при высеве 0,1 мл культуры штамма-реципиента, разведенного до 10^–5 микробных клеток, выросло 170 колоний, а при высеве неразведенной взвеси – 68 колоний, частота трансформации в этом случае будет равна:

,

где числитель – содержание рекомбинантных клеток в 1 мл смеси;

знаменатель – содержание клеток реципиента в 1 мл культуры сенной палочки.

Постановка опыта специфической трансдукции

В качестве реципиента берут лактозоотрицательный штамм (E. сoli lac^–) без галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг обозначают как фаг, в геноме которого часть генов замещена β-галактозидазным опероном E.coli. Фаг является дефектным и неспособен вызывать продуктивную инфекцию с лизисом кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, в то время как лактозоположительные приобретают красный цвет с металлическим оттенком. Для осуществления специфической трансдукции к 1 мл трёхчасовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10⁶-10⁷ частиц в 1 мл. После чего смесь инкубируют при 37С в течение часа. Затем в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий для получения сосчитываемого количества колоний готовят десятикратные разведения. Из пробирки с разведением 10^–6 высевают по 0,1 мл на три чашки Петри с селективной средой и равномерно распределяют посев шпателем по её поверхности. После инкубации посевов в течение 24 часов вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток трансдуктантов, обнаруженных на всех чашках, к числу клеток штамма-реципиента, исходя из того, что каждая колония образовалась в результате размножения только одной бактериальной клетки. Например, если после посева 1 мл смеси реципиента и трансдуцирующего фага в разведении 10^-6 на трёх чашках со средой Эндо выросло соответственно 170, 138 и 160 бесцветных колоний, а на первой и третьей пять и одна колония трансдуктантов красного цвета, частота трансдукции будет составлять:

Постановка опыта конъюгации для передачи R – плазмиды, которая контролирует множественную устойчивость к стрептомицину (Str^r), тетрациклину (Тс^r) и хлорамфениколу (Сm^r). В качестве донора используют лейциноотрицательный антибиотикорезистентный штамм кишечной палочки E. coli К12 R+ leu- Str^r Tc^r Cm^r, а реципиент – E. coli К12 R- leu+ Str^r Tc^S Cm^S. Для постановки опыта в стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора и реципиента. После инкубации смеси при 37^оС в течение двух часов её высевают в объёме 0,1 мл на чашку с селективной минимальной глюкозосолевой средой и тремя антибиотиками в концентрации по 50 мкг/мл каждого. На данной среде вырастут только рекобинантные колонии (трансконъюганты), которые приобрели резистентность к стрептомицину, тетрациклину и хлорамфениколу. Донорский штамм не вырастет на этой среде потому, что он нуждается в лейцине, а реципиентный штамм – чувствителен к антибиотикам. Частоту формирования трансконъюгантов можно определить по отношению числа рекомбинантных клеток к числу клеток штамма – реципиента рис. 2). Можно привести пример определения частоты формирования трансконъюгантов. Если при высеве 0,1 мл культуры штамма-реципиента в разведении 10^-4 на глюкозосолевую среду с лейцином, образовалось 20 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси – 60 колоний трансконъюгантов, частота их формирования определяется так: