5. Насколько достоверны результаты бактериоскопического исследования мазков мокроты?

К. Томен (K. Toman)

Чтобы оценить достоверность количественных результатов бактериоскопическо-го исследования мазков мокроты, необходимо ответить на следующие вопросы:

1. Какова вероятность обнаружения кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в мазках, приготовленных из образцов мокроты с низкой, средней и высокой концентрацией этих бактерий?

2. Какова вероятность получения ложноположительных результатов при ис­следовании образцов мокроты, в действительности не содержащих тубер­кулезных микобактерий?

3. Какова частота совпадения результатов бактериологического исследова­ния мазков, приготовленных из одних и тех же образцов мокроты, у раз­ных специалистов или в различных лабораториях?

Частично ответ на первый вопрос приведен в табл. 1 главы 4 «Сколько ту­беркулезных микобактерий содержится в образце мокроты при положитель­ных результатах микроскопии ее мазков?». Приведенные в этой таблице пока­затели получены из экспериментальных исследований и экстраполированы с предположением, что все бактерии равномерно распределены в образце мо­кроты. Однако, поскольку число бактерий в разных образцах мокроты раз­лично, такие количественные исследования должны быть выполнены на большом количестве образцов. При этом в качестве контрольного критерия должны быть использованы результаты культурального исследования мокро­ты [1]. В нескольких исследованиях [2, 3] число бактериальных клеток, выяв­ленных при бактериоскопии мазков, сравнивали с количеством колоний, по­лученных при посеве тех же образцов мокроты.

¹ David H.L. et al. Sensitivity and specificity ofacid-fast microscopy. Atlanta, GA, United States Department of Health, Education and Welfare, Centers for Disease Control (unpublished document prepared for the WHO Expert Committee on Tuberculosis, Geneva, 1973).

Результатами совместного исследования, проведенного одновременно в восьми лабораториях, было подтверждено, что количество колоний, обнару­живаемых при повторном исследовании одних и тех же образцов мокроты, ва­рьируется в минимальной степени¹. Тем не менее эти колебания не являются случайными, но имеют определенные границы. Различия же в результатах ис­следования разных образцов мокроты были обусловлены в основном разной концентрацией бактерий в этих образцах. Поэтому был сделан вывод о наличии

прямой корреляции между количеством жизнеспособных бактерий в образце мокроты, количеством КУМ в мазках мокроты и вероятностью их обнаружения при бактериоскопическом исследовании мазков. Как и ожидалось, полученные результаты (табл. 2) показали, что вероятность выявления КУМ в мазках тем выше, чем больше этих микроорганизмов имеется в мокроте. При графическом изображении этих данных были получены кривые, показывающие 50% вероят­ность обнаружения КУМ в мазках при наличии около 6 000 микроорганизмов в 1 мл мокроты. Аналогичные результаты проводившихся исследований были опубликованы и ранее [2, 3].

Таблица 2

Количество кислотоустойчивых микобактерий в мазках, концентрация растущих микобактерий в мокроте и вероятность получения положительного результата микобактериоскопического исследования''

Количество выявленных микобактерий

0 в 100 полях зрения или более⁶

1-2 в 300 полях зрения 1-9 в 100 полях зрения 1-9 в 10 полях зрения 1-9 в каждом поле зрения 10 и более в каждом поле зрения

Оценочная концентрация микобактерий в 1 мл мокроты

<1 000

5 000-10 000 около 30 000 около 50 000 около 100 000 около 500 000

Вероятность получения положительного результата

<10%

50% 80% 90% 96,2%

99,95%

^а Источник: пункт 1 в списке литературы.

^б Около 0,01 мл гомогенизированной мокроты помещали на предметное стекло и равно­мерно распределяли на поверхности площадью около 200 мм². Площадь одного поля зрения при использовании объектива с иммерсией и при увеличении в 1 000 раз состав­ляет около 0,02 мм². Таким образом, один мазок состоит примерно из 10 000 таких по­лей зрения (см. главу 4 «Сколько туберкулезных микобактерий содержится в образце мокроты при положительных результатах микроскопии ее мазков?»).

Чтобы проверить эти данные, Дэвид (David) и соавт. [1] попытались определить вероятность получения отрицательного результата при бактериоскопическом ис­следовании образцов мокроты, содержащих различные количества туберкулезных бактерий. В трех независимых исследованиях был изучен 431 образец мокроты. Количество микроорганизмов варьировалось от 1500 до 300 000 в 1 мл мокроты.

Каждый лабораторный работник должен был исследовать препараты из всех образцов мокроты, взятых у группы отобранных больных. Единообразие методи­ки приготовления мазков и их изучения во всех лабораториях было обеспечено стандартным протоколом исследования. Работа была организована таким обра­зом, что ни один участник не знал результатов, полученных в других лаборатори­ях, или от кого был взят тот или иной материал, и не имел каких-либо других све­дений, которые могли бы повлиять на конечные итоги исследования. Процент отрицательных результатов исследования мазков представлен в табл. 3.

Результаты, представленные в табл. 3 показывают, что вероятность получе­ния ложноотрицательных результатов постоянно уменьшается с возрастанием концентриции микроорганизмов в исследуемом образце. Когда концентрация возбудителей туберкулеза превышает 100 000 в 1 мл мокроты, вероятность от­рицательного результата бактериоскопического исследования приближается к нулю. Это подтверждает ранее известные данные о том, что если результаты изучения мазков стабильно положительны, где бы и кем бы они ни исследова­лись, то количество КУМ в 1 мл мокроты составляет 10⁵-10⁶ и более.

Таблица 3

Вероятность получения отрицательного результата бактериоскопического исследования препаратов, приготовленных из образцов мокроты с различным количеством кислотоустойчивых микобактерий (по данным посева)^а

Оценочная концентрация ^{Номер эксперимента}

микобактерий 1 2 3 В среднем,⁰/)

в 1 мл образца мокроты

Отрицательные результаты, %

1 500	-	85	92	88,5
3 000	84	83	77	81,3
15 000	25	28	6	19,6
30 000	16	30	6	17,3
150 000	0	0	5	1,6
300 000	0	0	0	0,0
Число исследованных мазков	42	100	289	-

Воспроизведено с незначительными редакторскими изменениями из David HL et al. Sensitivity and specificity of acid-fast microscopy. Atlanta, GA, United States Department of Health, Education and Welfare, Centers for Disease Control (unpublished document pre­pared for the WHO Expert Committee on Tuberculosis, Geneva, 1973).

Однако использование культурального метода для оценки количества тубер­кулезных бактерий в мокроте имеет определенные ограничения; имеются суще­ственные методические трудности, препятствующие получению точных резуль­татов этим методом. Необходимо исследовать сравнительно большое число образцов; при этом нужно использовать специальную методику, чтобы свести к минимуму количество технических ошибок, неизбежных в тех случаях, когда значительная часть содержащихся в мокроте бактерий находится в виде скопле­ний: не представляется возможным определить, является ли каждая колония на поверхности питательной среды результатом размножения одной бактериальной клетки или скопления множества бактерий. С другой стороны, КУМ, обнаружи­ваемые при бактериоскопии, не всегда дают рост колоний при культуральном ис­следовании, например из-за их гибели или вследствие угнетенного метаболизма (см. главу 6 «Каковы основные причины ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов бактероскопии мазков мокроты?»). Поэтому исследователи должны выбирать метод, который не зависит от результатов посева.

Так как целью исследования было определение достоверности (воспроизво­димости результатов) метода бактериоскопического исследования мазков мок­роты, проводили сравнение результатов, полученных несколькими профессио­нальными бактериологами, которые изучали мазки, приготовленные из одних и тех же образцов мокроты. Независимо от того, были ли ответы правильными или неправильными, определяли частоту совпадения или несовпадения резуль­татов, полученных разными специалистами. Каждый специалист проводил не­зависимое исследование мазков в соответствии со специальным протоколом. Все исследование было организовано следующим образом.

Изучение 54 образцов мокроты было проведено четырьмя бактериолога­ми. Из каждого образца готовили по 4 мазка — по одному для каждого из спе­циалистов, выполнявших независимые исследования. Результаты четырех анализов каждого образца мокроты оценивали по шкале, используя следую­щие обозначения: отрицательные результаты; скудное количество (1—9 КУМ в 100 полях зрения микроскопа) и положительные результаты + , 2+ и 3+). Результаты исследования каждого образца сравнивали по отдельности; ре­зультаты, полученные каждым специалистом, сравнивали с результатами ос­тальных трех бактериологов во всех возможных сочетаниях. Таким образом, получали 12 результатов исследования каждого из образцов мокроты. Ис­пользование данного метода создавало возможность построить корреляци­онную таблицу (табл. 4), отражающую частоту совпадений и расхождений результатов, полученных четырьмя микроскопистами. Итоговое количество сравнительных результатов составило 648, из которых 4 результата не были зарегистрированы.

Результаты, представленные в табл. 4, показывают, что чаще всего совпа­дение результатов отмечалось при крайних оценках, т. е. при отрицательных ответах и при 3+ (все идентичные результаты располагаются в таблице по ди­агонали сверху вниз слева направо). Более того, из этой же таблицы видно, что если, по данным одного из специалистов, результат исследования был отрицательным или количество КУМ было незначительным, то другие спе­циалисты дали заключение о положительном результате + , 2+ или 3+) только в 22 (7%) из 309 случаев. Другими словами, совпадение результатов было отмечено в 287 (93%) из 309 случаев. Аналогичным образом, если один специалист считал результаты анализа положительными, вероятность совпа­дения его результатов с ответами других специалистов составляла 93% (311 из 335 случаев).

Самая низкая частота совпадения результатов была отмечена в тех случаях, когда результаты исследования мазков мокроты расценивались как скудное число КУМ (см. табл. 4). Так, если один специалист выставлял подобную оцен­ку, то несовпадение ответов других специалистов было отмечено в 36 (88%) слу­чаях из 41. Отрицательные результаты микроскопии были отмечены другими специалистами в 24 (59%) случаях из 41. Эти данные соответствуют наблюдени­ям других специалистов, исследовавших мокроту больных с симптомами легоч­ных заболеваний. Отрицательные результаты посева мокроты имели место у 3 из 4 таких больных, хотя в мазках мокроты у них находили 1—2 КУМ (HG ten

Таблица 4

Частота совпадения или расхождения результатов, полученных четырьмя специалистами

3+

Результаты, полученные одним

специалистом

Результаты, полученные всеми другими специалистами^б

1 +

2+

незначи-отрица- тельное тельные количес­тво

Общее число наблюдений

25 5

44

Отрицательные незначительное количество"³

1+ 2+ 3+

Всего

233 24

82 28 04

267

11

16

4

40

18

39

115

49

0	268 '	309
4	41 J
4	43	335
50	115
120	177
178	644

311

333

^а Источник: David H.L. et al. Sensitivity and specificity of acid-fast microscopy. Atlanta, GA, United States Department of Health, Education and Welfare, Centers for Disease Control (unpublished document prepared for the WHO Expert Committee on Tuberculosis, Geneva,

1973).

^б Цифры в прямоугольнике указывают на частоту положительных ответов, данных всеми

специалистами (т. е. 1+, 2+, 3+). ^в Обнаружение 1-9 КУМ в 100 полях зрения микроскопа.

Dam, 1976, неопубликованные наблюдения). Бактериовыделение при данном классическом исследовании, выявившем методом бактериоскопии 1—2 КУМ в препарате, расценивалось как незначительное (или недостаточное). В подоб­ных ситуациях следует повторять исследование мазков мокроты.

Что касается положительных результатов, то полученные данные показали уменьшение частоты совпадения результатов в тех случаях, когда оценка была ниже, чем 3+ (табл. 5). Согласно приведенным в таблице данным, совпадение результатов при оценках 1+ и 2+ отмечалось сравнительно редко — в 25 и 34% случаев (см. цифры по диагонали). Таким образом, возможность дифференци­ровать оценки 1+ и 2+ представляется весьма иллюзорной.

Описанный выше эксперимент подтвердил высокую достоверность (вос­производимость) результатов, получаемых при бактериоскопическом исследо­вании мокроты. При независимом исследовании мазков, приготовленных из одних и тех же образцов мокроты, частота совпадения результатов, полученных специалистами равной квалификации, может достигать 93%. Однако такие хо-

Таблица 5

Частота совпадения результатов, полученных каждым из четырех специалистов, с результатами других специалистов при наличии КУМ в мазках мокроты (данные из табл. 4 представлены в процентах)

Результаты, полученные другими Всего, %

специалистами

		отрица­тельный	незначи­тельное коли­чество	1+	2+	3+
Результаты	1+	19	5	25	42	9	100
полученные одним	2+	2	7	14	34	43	100
специалистом	3+	0	2	2	28	68	100

рошие результаты были получены в условиях эксперимента, в котором участво­вали достаточно опытные лабораторные работники. В связи с этим возникает закономерный вопрос: «Насколько надежны результаты бактериоскопии, вы­полняемой в полевых условиях, особенно в периферийных медицинских уч­реждениях развивающихся стран?» Ответ на этот вопрос приведен ниже.

Бактериоскопия мазков в полевых условиях в развивающихся странах

В периферийных медицинских учреждениях все манипуляции (сбор мокроты, приготовление и окраска мазков, а также их бактериоскопическое исследова­ние) обычно выполняются в условиях, не являющихся оптимальными, причем нередко недостаточно опытными лабораторными работниками. Это относится к большинству периферийных медицинских учреждений, расположенных в сельской местности, ведь именно сюда обращается большинство больных с жалобами на симптомы со стороны дыхательной системы. Как правило, та­ким больным предлагается провести диагностическое исследование мокроты. Это означает, что качество диагностики туберкулеза легких в развивающихся странах зависит не только от ее организации, но и от технических возможнос­тей бактериоскопии мазков мокроты на местах.

Национальный институт туберкулеза в Бангалоре, Индия, провел серию ис­следований по оценке качества бактериоскопии мокроты в сельских лечебных учреждениях [4, 5]. Локальная противотуберкулезная программа была принята и начала осуществляться в одном из округов южной Индии за 6 мес до прове­дения этих исследований. Для выполнения последних методом случайной вы­борки было отобрано 9 медицинских учреждений. Бактериоскопическое иссле­дование в этих учреждениях выполняли работники, не имевшие специальной подготовки, но прошедшие обучение в течение 2—4 нед по методике взятия и исследования мокроты в соответствии с методическими рекомендациями

(данный документ был выдан каждому из этих сотрудников). Их обучение про­вел опытный лабораторный работник — член бригады по борьбе с туберкуле­зом [6, 7], отвечавший за внедрение и осуществление программы во всем райо­не с населением около 1,5 млн человек.

Метод оценки

В каждом из 9 учреждений от каждого больного с жалобами на длительный ка­шель собирали по одному образцу мокроты, из которого на месте готовили и ис­следовали мазок. Затем данный мазок вместе с образцом мокроты направляли в лабораторию Национального института туберкулеза, которая являлась рефе-ренс-лабораторией. Здесь проводили повторное исследование мазка мокроты; кроме этого готовили также новый мазок (дубликат) и проводили культуральное исследование мокроты. Результаты, полученные в периферийных медицинских учреждениях, сравнивали с результатами, полученными в референс-лаборато-рии. Материалом для сравнения служили следующие данные:

• повторное исследование ранее приготовленного мазка;

• исследование нового мазка (дубликата);

• результаты посева мокроты.

Сравнительный анализ случаев гипо— и гипердиагностики проводили по каждому учреждению в отдельности. В качестве эталона использовали резуль­таты культурального исследования. Из 1681 образца мокроты культуры возбу­дители туберкулеза удалось выделить в 228 (13,6%) случаях; в 1453 (86,4%) слу­чаях результаты культурального исследования были отрицательными.

Ложноположительные результаты бактериоскопии при отрицательных результатах посева

Для оценки частоты ложноположительных результатов в периферийных меди­цинских учреждениях в качестве стандарта использовали полученные в рефе-ренц-лаборатории отрицательные результаты культурального исследования. С ними и сравнивали данные, полученные в периферийных медицинских уч­реждениях (табл. 6).

Результаты посевов были отрицательными при изучении 1453 образцов мокроты. При этом бактериоскопия мазков в периферийных медицинских центрах дала положительные ответы в 2,6% случаев. Повторные исследования этих же образцов мокроты в референс-лаборатории показали, что положи­тельные результаты получены в 1,3% случаев. Таким образом, частота ложно-положительных результатов в периферийных медицинских учреждениях в среднем была выше, чем в референс-лаборатории. Однако более детальный анализ показал, что эти различия были связаны в основном с результатами, полученными только в одном из периферийных медицинских центров (уч­реждение Д). При исключении материалов этого медицинского учреждения из анализа частота ложноположительных результатов снижалась до 1,9%. При исследовании мазков-дубликатов частота ложноположительных резуль­

татов составляла 1,2%, тогда как при повторном исследовании одних и тех же мазков — 1,3% [5].

Ложноотрицательные результаты бактериоскопии при положительных результатах посева

Для оценки частоты получения ложноотрицательных результатов в перифе­рийных медицинских учреждениях в качестве стандарта использовали полу­ченные в референс-лаборатории положительные результаты культурального исследования, а также сравнивали результаты исследования одних и тех же мазков в периферийном медицинском учреждении и в референс-лаборато-рии (табл. 7).

Положительные результаты посева получены из 228 образцов мокроты. В том числе положительные ответы при бактериоскопии мазков были отмече­ны в 87 (38,2%) случаях по материалам периферических медицинских центров, и в 67 (29,4%) случаях по результатам референс-лаборатории. Таким образом, гиподиагностика в периферийных центрах имела место чаще, чем в референс-лаборатории (38 и 29,4% соответственно). Эти различия были связаны преиму­щественно с ошибочными результатами, полученными в двух медицинских учреждениях (Г и З). При исключении материалов этих двух медицинских уч-

Таблица 7

Ложноотрицательные результаты исследования мазков мокроты, из которых были выделены культуры возбудителя туберкулеза, полученные в периферийных медицинских учреждениях и в референс-лаборатории³

Количество образцов, оцененных как ^{Общее количество} отрицательные при бактериоскопии

образцов

Центр

	с положительным результатом посева	периферийные медицинские учреждения	референс-
			лаборатория
А	101	27	26
Б	21	7	8
В	23	7	5
Г	22	19	9
Д	15	6	6
Е	16	5	4
Ж	15	7	5
З	10	8	3
И	5	1	1
Всего	228 (100%)	87 (38,2%)	67 (29,4%)

Источник: пункт 5в списке литературы.

реждений из анализа частота ложноотрицательных результатов в периферий­ных медицинских учреждениях и референс-лаборатории была практически одинаковой — соответственно 23 и 26%.

Авторы данной работы пришли к выводу [5], что ложноположительные ре­зультаты бактериоскопического исследования являлись проблемой только для одного из девяти периферийных медицинских учреждений. Специалисты счи­тают, что дополнительное обучение лабораторных работников или какие-либо другие меры смогут ликвидировать этот недостаток. В равной мере это отно­сится и кложноотрицательным результатам, полученным в двух периферийных медицинских учреждениях, где необходимо провести обучение сотрудников и более тщательно контролировать их работу. Сравнение результатов, получен­ных в других лабораториях Индии [8, 9], подтвердили почти аналогичные пока­затели частоты ложноположительных и ложноотрицательных результатов, если в качестве эталона для сравнения используют результаты посева мокроты.

Авторы также сделали вывод о том, что даже сотрудники медицинских учреждений общего профиля, не имеющие специализации, могут успешно выполнять бактериоскопическое исследование мазков мокроты. Учитывая, что продолжительность обучения лабораторных работников методу бакте­риоскопии обычно невелика, можно предположить, что при осуществлении постоянного контроля за их работой и периодической их переподготовки они будут достаточно качественно выполнять бактериоскопические анализы (см. главу 6 «Каковы основные причины ложноположительных и ложноотри-цательных результатов бактериоскопии мазков мокроты?»).

Подобное же исследование с использованием аналогичного метода было выполнено в Алжире [10]. При изучении мазков мокроты, приготовленных не­специалистами в периферийном медицинском учреждении, и при их повтор­ном исследовании в центральной лаборатории были получены весьма сходные результаты. В частности, при двукратном исследовании 104 мазков идентич­ные оценки были даны в 95% случаев. Из 86 мазков, оцененных в центральной лаборатории как отрицательные, только в 2 случаях неспециалистами было да­но заключение о положительных результатах исследования на туберкулезные бактерии. Число ложноотрицательных результатов было также невелико — в 3 из 18 случаев. Авторы считают целесообразным применение метода бакте­риоскопии мазков мокроты в периферийных медицинских учреждениях при условии осуществления контроля со стороны центральной лаборатории. Более того, они справедливо указывают на необоснованность использования более сложных методов диагностики или попытки добиться большей точности иссле­дования в условиях, когда медицинские учреждения не могут обеспечить пол­ноценное лечение каждого больного с установленным диагнозом туберкулеза, что является конечной целью всей работы по выявлению заболевших.

Результаты обоих полевых исследований показали, что бактериоскопичес-кое изучение мазков мокроты, осуществляемое сотрудниками без специальной профессиональной подготовки, может быть достаточно надежным. Обучение таких сотрудников может быть проведено без отрыва от производства квалифи­цированными лабораторными работниками. Однако для того, чтобы обеспе­чить достаточный уровень профессионализма, необходимо проводить переобу­чение тех сотрудников, результаты работы которых не удовлетворяют стандарт­ным требованиям. Хорошим методом оценки качества бактериоскопических анализов, выполняемых в периферийных медицинских учреждениях, и конт­роля за их работой является повторное изучение поступивших оттуда мазков мокроты или исследование мазков-дубликатов, приготовленных в референц-лаборатории из тех же образцов. На более поздней стадии внедрения програм­мы борьбы с туберкулезом, когда возникнет возможность проведения культу-рального метода исследования мокроты, для постановки первичного/предва­рительного диагноза следует по-прежнему использовать прямую бактериоско­пию мазков, а культуральный метод применять, если есть возможность для подтверждения клинического диагноза и оценки результатов химиотерапии.

Литература

1. David H.L. Bacteriology ofthe mycobacterioses. Atlanta, GA, United States Department of Health, Education and Welfare, Communicable Disease Center, 1976:147.

2. de Carvalho E. Was leistet die mikroskopische Untersuchung, das Kulturverfahren und der Tierversuch bei der Ermittlung kleinster Tuberkelbazillenmengen im

Untersuchungsmaterial? [How useful are microscopy, culture methods, and ani­mal experiments in determining the smallest amounts of tubercle bacilli in sam­ples?] Zeitschrift fur Tuberkulose, 1932, 63:305—317.

3. Cruickshank D.B. Bacteriology of tuberculosis. In: Sellors T.H., Livingston J.L., eds. Modern practice of tuberculosis. Vol 1. London, Butterworths, 1952:53—77.

4. Rao K.P. et al. Assessment of diagnosis of pulmonary tuberculosis by sputum microscopy in a district tuberculosis programme. Indian Journal of Tuberculosis,

1971, 18:10—21.

5. Nagpaul D.R. et al. Case-finding by microscopy. Bulletin of the International Union Against Tuberculosis, 1968, 61:148—158.

6. Toman K. Tuberculosis. The training of key-organizers. Bulletin of the International Union Against Tuberculosis, 1970, 43:165—169.

7. Nagpaul D.R. Tuberculosis control teams. Indian Journal of Tuberculosis, 1972,

19:3—11.

8. Holst E., Mitchison D.A., Radhakrishna S. Examination of smears for tubercle bacilli by fluorescence microscopy. Indian Journal of Medical Research, 1959,

47:495—99.

9. Sikand B.K, Ranga Rao R. A simple pre-treatment technique for sputum compri- sing the use of a combination of pancreatin and cetavlon for the routine cultivation of tubercle bacilli. Indian Journal of Tuberculosis, 1958, 5:76—86.

10. Boulahbal F., Mazouni L., Chaulet P. Prospective study of the organization and supervision of the bacteriological diagnosis of pulmonary tuberculosis in a case-finding network in Algeria. Bulletin of the International Union Against Tuberculosis,

1976, 51:313—321.