18. Какова роль в настоящем и, возможно, в будущем диагностических тестов помимо бактериоскопии мазков и посева мокроты?

Д. Мензиз (D. Menzies)¹

Исследование мазков мокроты на присутствие кислотоустойчивых микобакте­рий (КУМ) является недорогим и высокоспецифичным методом выявления источников распространения туберкулеза. Однако возможности этого метода могут ограничиваться в связи с тем, что его проведение требует относительно интенсивной лабораторной работы. В условиях недостаточного опыта, слабой мотивации, спешки и при отсутствии соответствующего контроля выявление КУМ проводится на уровне ниже необходимых требований, и результаты его бывают далеки от возможных. В Африке, где число случаев туберкулеза воз­росло в 2—4 раза, один из каждых четырех больных, диагностированный при выявлении как «c отрицательным результатом бактериоскопии мазков мокро­ты», в действительности выделяет микобактерии по результатам правильно проведенной бактериоскопии [1]. Кроме того, выявление КУМ в мазках мок­роты предусматривает как минимум двукратное посещение пациентом меди­цинского учреждения. Невыполнение этого требования приводит к тому, что даже правильно проведенное бактериологическое исследование позволяет об­наружить скудное бактериовыделение только методом посева (см. главу 9 «Ка­кова роль культурального метода исследования в диагностике и выявлении случаев заболевания туберкулезом?»). Такие пациенты в значительно меньшей степени влияют на распространение туберкулеза в обществе и на смертность от него. Однако их своевременное выявление и соответствующее лечение спо­собны значительно снизить нагрузку и повысить эффективность работы кли­ник и органов общественного здравоохранения, ответственных за борьбу с ту­беркулезом. Существует необходимость в быстром и недорогом тесте, выпол­нять который было бы проще, чем исследование мазков на КУМ, и который мог бы идентифицировать случаи туберкулеза c отрицательными результатами бактериоскопии мазков мокроты и внелегочного туберкулеза. В данном разде­ле не рассматриваются химические тесты, используемые при диагностике вне-легочного туберкулеза (например, определение аденозиндеаминазы, туберку-лостеариновой кислоты и др.).

Директор туберкулезной клиники Монреальского института патологии органов грудной клетки Университета Мак-Гилл, Монреаль (Канада).

Иммунологические тесты Кожный туберкулиновый тест

Кожные туберкулиновые тесты используются в клинике уже более 90 лет (см. главу 17 «Какова роль определения кожной чувствительности к туберкулину в диагностике туберкулеза?»). Однако с их помощью нельзя отличить инфици­рование от заболевания туберкулезом. Кроме того, отрицательные реакции на туберкулин могут иметь место у многих пациентов на начальном этапе заболе­вания. Поэтому туберкулиновые тесты играют незначительную роль в диагнос­тике туберкулеза у взрослых.

Серологические методы

Термин «серологические тесты» относится к методам измерения гуморальных реакций (антител, прежде всего иммуноглобулина G) на микобактерии тубер­кулеза. Роберт Кох (Robert Koch) предложил первые из серологических тестов еще в 1898 г., и с тех пор, спустя более чем столетие, не было предложено серо­логического теста, обладающего достаточной чувствительностью и специфич­ностью. Объяснением этого может служить то обстоятельство, что иммунные реакции на туберкулезную инфекцию имеют преимущественно клеточный, а не гуморальный характер [2]. Недавно проведенные исследования показали, что гуморальные реакции на туберкулезные микобактерии весьма гетерогенны [3, 4]. Одно из таких исследований показало, что у 52 (88%) из 59 больных ак­тивным туберкулезом в крови циркулировали антитела по меньшей мере к од­ному из 10 микобактериальных антигенов. Однако менее половины этих боль­ных реагировали на какой-либо один из этих антигенов [4].

Более ранние из серологических тестов использовали весьма грубые экс­тракты микобактерий типа туберкулина, применяемого для кожных тестов, и обладали малой чувствительностью и специфичностью [2]. Более поздние тесты, проводившиеся с антигенами высокой степени очистки, обладали бо­лее высокой чувствительностью и специфичностью [2]. Основное достоин­ство подобных тестов состоит в том, что ответы можно получить уже через 1 час, кроме того, они просты в выполнении, не требуют сложного оборудо­вания и высококвалифицированного персонала. В последнее время матери­алы для серологических тестов [5] производятся многими предприятиями, они легко доступны и относительно недороги (около 1 долл. США на тест). Последнее обстоятельство делает их привлекательными в странах с ограни­ченными ресурсами, где они усиленно рекламируются. Однако основными недостатками подобных тестов остаются их недостаточная чувствительность и специфичность [5, 6]. Примечательно, что самая высокая чувствительность серологических проб отмечается у больных с положительными результатами бактериоскопии мазков мокроты на КУМ [3, 7, 8]. В то же время чувстви­тельность оказывается гораздо ниже у детей [9], у больных внелегочным ту­беркулезом [8, 10], у ВИЧ-инфицированных больных [11] и у пациентов с от­рицательными результатами бактериоскопии мазков мокроты [8, 10]. Таким образом, низкая чувствительность серологических тестов оказывается низ­кой именно у тех контингентов больных, у которых из-за недостаточной чув­ствительности метода бактериоскопии серологические тесты могли бы быть наиболее полезными. Специфичность серологических тестов оказалась на­иболее высокой у здоровых добровольцев из стран с низкой распространен­ностью туберкулезной инфекции [3, 7]. Эти тесты оказались гораздо менее специфичными у лиц, контактирующих с больными активным туберкуле­зом, у пациентов с подозрением на активный туберкулезный процесс и у на­селения стран со значительной распространенностью туберкулезной инфек­ции [ 6]. Серологические тесты не могут надежно дифференцировать больных активным туберкулезом от лиц, инфицированных микобактериями туберку­леза. Поэтому в настоящее время (2003 год) серологические тесты не играют роли в диагностике туберкулеза.

Оценка клеточного иммунитета

Достижения молекулярной биологии за последнее десятилетие сопровожда­лись разработкой и резким увеличением количества тестов по определению клеточного иммунитета при туберкулезе. Лимфоциты, экстрагированные из ве­нозной крови, экспонировались с очищенными антигенами микобактерий ту­беркулеза, после чего определяли продукцию ими медиаторов воспаления или цитокинов (прежде всего у-интерферона) [ 12].

Главное теоретическое достоинство данных методов состоит в том, что изуча­ется непосредственная иммунная реакция макроорганизма на туберкулез. Но, с другой стороны, состояние анергии в момент постановки диагноза отмечается у 20—47% больных с распространенным туберкулезным процессом [13—16]. Подобное состояние имеет временный характер и проходит при лечении в тече­ние 1 мес или более [17]. Тем не менее данный феномен снижает чувствитель­ность и информативность таких тестов, особенно в странах со значительной рас­пространенностью туберкулеза. Существенным недостатком подобных тестов является их значительная сложность. В настоящее время их удается выполнять только в немногих технически хорошо оснащенных исследовательских лаборато­риях индустриально развитых стран. Необходимо проведение дальнейших иссле­дований по упрощению и автоматизации методики выполнения таких тестов. Их более широкое применение в клинике станет возможным после уточнения их чувствительности, специфичности и прогностических возможностей.

Амплификационные тесты

Амплификационные тесты разработаны для многих микроорганизмов, в том числе и для микобактерий туберкулеза. Эти методы стали одним из приложе­ний достижений молекулярной биологии в клинической практике. Образцы высокоспецифичных нуклеиновых кислот (так называемые праймеры) распо­знаются и прикрепляются к соответствующим сегментам ДНК-мишеней. ДНК микроорганизма и праймер многократно реплицируются, копируясь все снова и снова, т. е. «амплифицируются». После завершения процесса амплификации полученная ДНК при добавлении к образцу исходного материала связывается исключительно с ДНК соответствующего микроорганизма. Это соединение можно уловить и оценить с помощью реакции колориметрии [ 18].

Главное достоинство описанной методики состоит в том, что ответы можно получить уже через несколько часов (однако выполнение некоторых из ампли-фикационных тестов требует нескольких дней [19]. Специфичность тестов до­стигает 98—100% [20], а чувствительность превышает 95% при исследовании образцов мокроты с положительными результатами бактериоскопии. Чувстви­тельность снижается до 50—60% при исследовании образцов мокроты с отри­цательными результатами бактериоскопии, но с положительными результа­тами посева [21—23]. Амплификационные тесты, разработанные в последнее время, обладают гораздо более высокой чувствительностью при столь же высо­кой специфичности [ 19, 20, 24].

Главными недостатками методов являются их высокая стоимость, техниче­ская сложность и высокая частота ложноположительных ответов, особенно при работе в полевых условиях [25, 26]. В лабораторных условиях тесты могут быть дешевле, но занимают более продолжительное время, весьма трудоемки и тре­буют высокой квалификации персонала [19]. Разработаны и созданы системы с высокой степенью автоматизации, но их начальная стоимость и затраты на эксплуатацию весьма высоки (более 15 долл. США за тест). Именно высокая стоимость наряду с технической сложностью не позволяют в настоящее время применять подобные тесты в странах с ограниченными ресурсами и со значи­тельной распространенностью туберкулеза. Правда, затраты на проведение те­стов могут быть доведены до 6 долл. США на исследование. Это делает их про­ведение экономически оправданным, так как позволяет раньше выявить больных активными формами туберкулеза и быстрее начать их лечение, пред­упредив тем самым прогрессирование заболевания. Надежды на амплификаци-онные тесты в значительной степени ослабевают в связи с высокой частотой ложноположительных результатов. Недостаточная чувствительность этих тес­тов при обследовании больных, не выделяющих микобактерии с мокротой, от­сутствие количественной оценки результатов и невозможность с их помощью отличить живые возбудители от утративших жизнеспособность — все это также ограничивает их преимущества, которые все же выше информативности бакте-риоскопических исследований мазков мокроты.

Резюме

Исследование мазков на присутствие КУМ остается недорогим и высокоспе­цифичным методом выявления и диагностики туберкулеза, требующим, тем не менее, интенсивной лабораторной работы. Однако этот метод оказывается не­эффективным у больных со скудным бактериовыделением или без него, а так­же при внелегочном туберкулезе. Более новые иммунодиагностические тесты стали предметом интенсивных исследований, поскольку они обещают быструю и точную диагностику. Однако для их выполнения необходимы оборудование, материалы и персонал, которые могли быть бы приемлемыми для стран с огра­ниченными ресурсами. В настоящее время отсутствуют серологические тесты, которые можно было бы рекомендовать для рутинного применения в клинике. Реакции клеточного иммунитета на антигены туберкулезных микобактерий применимы только в исследовательских учреждениях. Амплификационные те­сты весьма перспективны благодаря своей высокой чувствительности, потен­циально хорошей специфичности и возможности их постановки непосред­ственно на патологическом материале, например образцах мокрот. Однако в настоящее время их использование в странах с ограниченными ресурсами ос­тается нереальным из-за высокой стоимости оборудования и материалов, а так­же в связи с низкой специфичностью при работе в полевых условиях. Ни один из новых методов исследования не дает количественной характеристики бакте-риовыделения с мокротой. Таким образом, если даже новые, недорогие и до­статочно простые методы станут доступными, бактериоскопическое исследо­вание мокроты на КУМ останется необходимым для идентификации и монито­ринга больных с наиболее контагиозными и тяжелыми формами туберкулеза.

Литература

1. Hawken M.P et al. Under-diagnosis of smear-positive pulmonary tuberculosis in Nairobi, Kenya. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 2001, 5:360—363.

2. Daniel T.M., Debanne S.M. The serodiagnosis of tuberculosis and other mycobac­terial diseases by enzyme-linked immunosorbent assay. American Review of Respiratory Disease, 1987, 135:1137—1151.

3. Verbon A. et al. Evaluation of different tests for the serodiagnosis of tuberculosis and the use of likelihood ratios in serology. American Review of Respiratory Disease,

1993, 148: 378—384.

4. Lyashchenko K. et al. Heterogeneous antibody responses in tuberculosis. Infection and Immunity, 1998, 66:3936—3940.

5. Pottumarthy S., Wells V.C., Morris A.J. A comparison of seven tests for serological diagnosis of tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38:2227—2231.

6. Somi G.R. et al. Evaluation of the MycoDot test in patients with suspected tuber­culosis in a field setting in Tanzania. International Journal of Tuberculosis and Lung

Disease, 1999, 3:231—238.

7. Amicosante M. et al. Sensitivity and specificity of a multi-antigen ELISA test for the serological diagnosis of tuberculosis. International Journal of Tuberculosis and

Lung Disease, 1999, 3:736—740.

8. Zhou A.T. et al. Detection of pulmonary and extrapulmonary tuberculosis patients with the 38-kilodalton antigen from Mycobacterium tuberculosis in a rapid mem­brane-based assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 1996, 3:337—341.

9. Swaminathan S. et al. Serodiagnosis of tuberculosis in children using two ELISA kits. Indian Journal of Pediatrics, 1999, 66:837—842.

10. Al Zahrani K. et al. Accuracy and utility of commercially available amplification and serologic tests for the diagnosis of minimal pulmonary tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2000, 162:1323—1329.

11. Daniel T.M. et al. Reduced sensitivity of tuberculosis serodiagnosis in patients with AIDS in Uganda. Tubercle and Lung Disease, 1994, 75:33—37.

10. Mazurek G.H. et al. Comparison of whole blood interferon gamma assay with tuberculin testing for detecting Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of the American Medical Association, 2001, 286:1740—1747.

11. Holden M., Dubin M.R., Diamond P.H. Frequency of negative intermediate-strength tuber culin sensitivity in patients with active tuberculosis. New England

Journal of Medicine, 1971, 285:1506—1509.

14. Al Zahrani K., Al Jahdali H., Menzies D. Does size matter? Utility of size of tuber­culin reactions for the diagnosis of mycobacterial disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2000, 162:1419—1422.

15. Harrison B.D.W., Tugwell P., Fawcett I.W. Tuberculin reaction in adult Nigerians with sputum-positive pulmonary tuberculosis. Lancet, 1975:421—424.

16. Rooney J.J. et al. Further observations on tuberculin reactions in active tuberculo­sis. American Journal of Medicine, 1976, 60:517—521.

17. WHO Tuberculosis Research Office. Further studies of geographic variation in nat­urally acquired tuberculin sensitivity. Bulletin of the World Health Organization,

1955, 22:63—83.

18. Eisenach K.D. et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a poly-merase chain reaction. American Review of Respiratory Disease, 1991,

144:1160—1163.

19. Kambashi B. et al. Utility of nucleic acid amplification techniques for the diagno­sis of pulmonary tuberculosis in sub-Saharan Africa. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 2000, 5:364—369.

20. Catanzaro A. et al. The role of clinical suspicion in evaluating a new diagnostic test for active tuberculosis. Results of a multicenter prospective trial. Journal of the American Medical Association, 2000, 283:639—645.

21. Clarridge J.E. et al. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. Journal of

Clinical Microbiology, 1993, 31:2049—2056.

22. Abe C. et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by polymerase chain reaction and the gen-probe amplified Mycobacterium tubercu­losis direct test. Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31:3270—3274.

23. Wobester W.R. et al. Evaluation of Roche Amplicor PCR Assay for Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34:134—139.

24. Bradley S.P., Reed S.L., Catanzaro A. Clinical efficacy of the amplified Mycobacterium tuberculosis direct test for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 1996, 153:1606—1610.

25. Burkardt H.J. Standardization and quality control of PCR analyses. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2000, 38:87—91.

26. Doucet-Populaire F. et al. A blind study of the polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis DNA. Azay Mycobacteria Study Group. Tubercle and Lung Disease, 1996, 77:358—362.

27. Roos B.R. et al. Cost-effectiveness of the polymerase chain reaction versus smear examination for the diagnosis of tuberculosis in Kenya: a theoretical model. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 1997, 2:235—241.