Определениеуровнясвободныхцитокиноввсупернатантахмононуклеарныхлейкоцитов периферическойкрови.

КультуруМЛинкубировали24часавростовойсредеRPMI-1640илиRPMI-1640+ФГА(5мкг/мл),затемисследовалиспонтаннуюииндуцированнуюпродукциюцитокиноввсупернатантахМЛ.Уровеньцитокиновопределялиприпомощитест-системыFlowCytomixHumanThl/Th211plexсиспользованиемшариков,сенсибилизированныхмоноклональнымиантителамикцитокинам(GM-CSF,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-17,TNF-a),производства

BenderMedSystems(Австрия).УровеньцитокиновопределялисогласноинструкциипроизводителясиспользованиемпроточногоцитометраFC-500(BeckmanCulter,США).Влунки24луночногокультуральногопланшетавносилипо2млразведенной(1:2)кровивсредеRPMI-1640(ПанЭко).ДлястимуляциииндукциицитокиновдобавлялиФГА(10мкг/мл,ПанЭко).Планшетыинкубировали30минпри37°С,5%СО2.Послеинкубациивлункидобавлялипо

4мклBrefeldinA(Biolegend,US)(доконечнойконцентрации10мкг/мл)ипомещаливС02инкубаторпри37°Сна15часов(наночь).Изкаждойлункиудалялипо1млжидкости,осадокперемешивалииокрашивалиPEилиFITC-меченымиантителамикповерхностнымклеточнымантигенам.МембранноеокрашиваниепроводилисиспользованиемМКАкCD8согласноинструкциипроизводителя(Biolegend,US).Вносили3-5мклантителвлункукруглодонногоиммунологическогопланшета,затемдобавляли50мклвзвесиклетокиинкубировали20минвтемномместеприкомнатнойтемпературе.Добавляли100мклФСБилисредыRPMIиотмывалипри350g3-5мин.Клеткификсировалив4%формальдегида,инкубировали20минприкомнатнойтемпературевтемнотеи

сноваотмывали.Пермеабилизацияклетокилизирование.Фиксированныеклеткиресуспендировалив150мклPermeabilizationWashBuffer(BioLegend).Отмываликлеткицентрифугированиемпри350g7миндваждыв150мклпермеабилизирующегобуфера.Окрашиваниевнутриклеточныхцитокинов.Далеевлункисклеткамидобавлялипо3-5мклантителкцитокинамипо40мклпермеабилизирующегобуфераиинкубировали20минприкомнатнойтемпературевтемноте.Центрифугировалидваждыпри300-450g3-5минсдобавлением1%формальдегидадляфиксации.УровеньцитокиновопределялинапроточномцитометреFC-500(BeckmanCulter, США).

СодержаниеобщихиммуноглобулиновА,G,МклассовпроводилиметодомрадиальнойиммунодиффузиивагаровомгелепоG.Mancini[242]спомощьюдиагностическихтест-наборовпроизводстваИнститутаиммунологииМЗРФ.

КоличественноеопределениеIgEпроводилиметодомИФАнабором«IgEобщий-ИФА-Бест»(ЗАО«Вектор-Бест»,г.Новосибирск).Принципметода:используетсятвердофазныйиммуноферментныйметодсприменениемероксидазыхренавкачествеиндикаторногофермента,основанныйнаметоде«сэндвича».

6. Дополнительныеметодыисследования

Всембольнымпроводилоськомплексноеврачебноеобследованиесцельювыявлениязаболеваний,препятствующихназначениюиммунокорригирующейтерапии,включающее:обследованиетерапевта,невропатолога,хирурга,уролога,гинеколога,эндокринолога,офтальмолога,отоларинголога,стоматолога,ЭКГ,УЗИоргановбрюшнойполости.

7. Статистическиеметоды

СтатистическуюобработкурезультатовпроводиливрамкахпараметрическойинепараметрическойбазовойстатистикисиспользованиемW-критерияShapiro-Wilk,t-критерияСтьюдента,U-критерияMann-Whitney,критерияWilcoxon,критерияPеаrsonиSpearman,методаХи-квадрат(χ2),применяястандартныйпакетстатистическихпрограммWindows7(StatSoft7.0),ExelиWinMdi.Различиярассматривалиськакзначимыеприp≤0,05.